30種中草藥對鱘魚源海豚鏈球菌的體外抑菌作用

姚 麗，董春燕，陳江鳳，黎 明，邵 儉，安 苗，王常安，王靜波，程振濤，姜海波,6，文 明

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211； 4.中國水產科學研究院 黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 5.北京市水產技術推廣站，北京 100176； 6.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州 貴陽 550025 )

鱘魚是現存起源最早的脊椎動物之一，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目。在全球的鱘形目種類中，自然分布在我國境內的鱘魚種類共2科3屬8種，分別是新疆的西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)、小體鱘(A.ruthenus)和裸腹鱘(A.nudiventris)，長江水系和珠江水系的中華鱘(A.sinensis)，黑龍江水系的施氏鱘(A.schrenckii)和達氏鰉(Husodauricus)，長江水系的達氏鱘(A.dabryanus)和白鱘(Psephurusgladius)[1]。鱘魚是我國重要的冷水性經濟魚類，其肉質鮮美，營養豐富。近年來，隨著養殖規模不斷擴大，養殖產量迅猛增加，至2017年我國鱘魚產量已達83 058 t[2]。然而，疾病頻發卻成為影響鱘魚養殖業可持續發展的最重要因素之一，尤其以細菌性疾病的危害最為嚴重。目前已報道的能夠誘發鱘魚細菌性疾病的主要致病菌有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3-6]、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[7-8]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[9]和海豚鏈球菌(S.iniae)[10]等。海豚鏈球菌屬芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于水環境、土壤和食物中。該菌感染宿主廣、致病力強，給水產、禽類以及人類健康帶來嚴重危害[11-12]。已有研究報道虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[13]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[14]等養殖魚類感染海豚鏈球菌，并導致嚴重經濟損失。

使用化學消毒劑和抗生素類藥物防治魚類細菌性疾病是當前水產養殖生產過程中的主要手段。但是長期使用此類藥物不僅破壞養殖水域環境，而且會導致病原菌產生耐藥性、魚體藥物殘留超標，進而影響水產品的食用安全性[15-17]。中草藥具有來源廣泛、毒副作用小、殘留少、安全性高、無殘留和療效好等特點，因此利用中草藥防治魚類細菌性疾病備受關注[18-21]?，F有研究表明，黃連、黃芩、大黃、黃柏、博落回、五倍子和石榴皮等中草藥對羅非魚源海豚鏈球菌具有較強的抑菌效果[22-24]，但針對鱘魚源海豚鏈球菌尚未見報道。筆者選取黃連等30種中草藥，研究其對鱘魚源海豚鏈球菌的體外抑菌作用，以期為防治鱘魚源海豚鏈球菌誘發的疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

海豚鏈球菌為北京市水產技術推廣站分離鑒定和保存提供。

1.2 試驗藥物

選取黃芩、黃連、金銀花、連翹、穿心蓮、山楂、生首烏、秦皮、射干、女貞子、豬苓、蒼術、蘇葉、黨參、茯苓、貫眾、竹柴胡、鳳尾草、薄荷、丹參、志遠、苦楝皮、丁香、金櫻子、石榴皮、野菊花、忍冬藤、青蒿、桔梗和使君子30種具有廣譜抗菌及消炎功效的中草藥為研究對象，試驗前將30種中草藥分別粉碎后過60目篩，干燥保存備用。

1.3 中草藥藥液制備

取上述30種中草藥各20 g，分別注入300 mL雙蒸水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火熬制30 min，4層紗布過濾，收集濾液，重復3次，合并3次濾液，濃縮至20 mL(即質量濃度1000 mg/mL)，經4000 r/min離心30 min后裝瓶高壓滅菌，放涼后置冰箱4 ℃保存備用[23]。

1.4 菌懸液的制備

取保藏菌種，接種血平板，28 ℃培養24 h。挑取單菌落于TSB液體試管中進行搖床培養24 h(28 ℃，140 r/min)，調整菌液密度為2×108～3×108cfu/mL，用于后續試驗。

1.5 中草藥平板抑菌試驗

采用牛津杯法[23]，即在無菌條件下，用直徑9 cm培養皿，將其平均分成3個區域，分別在固定位置放入高(10±0.1) mm、外徑(8±0.1) mm、內徑(6±0.1) mm的3只牛津杯內，并排列呈正三邊形，保持相鄰兩孔的距離大于3 cm，以免相鄰的抑菌圈重疊而影響測量準確性。待滅菌培養基冷卻至50 ℃時倒平板(30 mL/個)，放出部分水汽，放平，待其凝固后用無菌鑷子將牛津杯輕輕取出，留下3個大小一致的孔洞，并在底部的相應位置作好記號，在每個平皿內分別加入0.1 mL海豚鏈球菌菌液，用無菌玻璃涂布棒涂抹均勻，最后在孔洞里分別加入100 μL中草藥藥液，每個平皿中加1種藥液，每種藥液加3個平板孔作為平行樣，設置陽性對照(涂菌，打孔，加強力霉素)和空白對照(涂菌，打孔，加雙蒸餾水)，將平皿小心地平移至恒溫培養箱中，28 ℃培養24 h，培養后分別觀察并測量抑菌圈直徑大小，每孔取不同方向測量2次，最終求取3個平板共6次測量結果的平均值，以代表該種藥液抑菌效果[25-26]。判斷標準：抑菌圈直徑0～10 mm為低度敏感，10～20 mm為中度敏感，>20 mm為高度敏感[24,27]。

1.6 中草藥最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度的測定

采用二倍稀釋法[15,28]，測定30種中草藥水溶性提取物的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度。具體操作如下：取13支滅菌帶棉塞的試管(15×150)進行編號(1～13號)，首先在1～13號試管加入2.5 mL無菌液體培養基；其次在1號試管中加入2.5 mL原藥液混勻，隨后從1號中吸取2.5 mL加入2號試管，依次吸取2.5 mL混合液加入后面編號的各試管中直至11號試管，然后再從11號試管吸取2.5 mL丟棄；最后在1～11號試管中各加入100 μL菌液搖勻，12號試管加菌液不加藥液作為生長對照，13號試管加藥液不加菌液作空白對照。每種中草藥重復3次，于28 ℃的振蕩培養箱中培養24 h；培養結束后觀察1～13號試管內的細菌生長情況，其中無菌生長的最高稀釋質量濃度即為最小抑菌質量濃度。

在最小抑菌質量濃度試驗基礎上繼續培養24 h，觀察結果，清澈透明無混濁現象的試管即為無菌生長試管。無菌生長試管中的最低藥物質量濃度為最小殺菌質量濃度。

1.7 數據處理

采用SPSS 16對所得數據進行統計分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 中草藥水提物的抑菌圈結果

中草藥提取物對致病菌海豚鏈球菌的抑菌直徑見表1。結果顯示，海豚鏈球菌對黃連、丁香、連翹和黃芩4種中草藥高度敏感，抑菌圈直徑依次為(28.35±0.65)、(23.63±3.38)、(23.53±1.93) mm和(22.96±2.01) mm；海豚鏈球菌對生首烏、豬苓、蒼術、茯苓、貫眾和丹參6種中草藥低度敏感，其抑菌直徑分別為(8.63±0.00)、(8.56±0.00)、(9.29±2.19)、(9.37±1.15)、(9.45±0.45) mm和(8.06±0.46) mm；海豚鏈球菌對剩余20種中草藥中度敏感。

2.2 中草藥的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度

30種中草藥對海豚鏈球菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度結果見表2。黃連、黃芩、連翹和丁香4種高度敏感中草藥提取液對病原菌的最小抑菌質量濃度分別為1.95、1.95、3.90 mg/mL和3.90 mg/mL，最小殺菌質量濃度分別為3.90、15.62、7.81 mg/mL和15.62 mg/mL。秦皮雖然屬于中度敏感中草藥，但是其最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度均較低且相同，為7.81 mg/mL。其余19種中度敏感中草藥最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度均大于15.62 mg/mL。低度敏感中草藥中僅貫眾可獲得最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度，分別為500 mg/mL和>500 mg/mL。

表1 30種中草藥對海豚鏈球菌的體外抑菌圈Tab.1 Antibacterial effects of 30 Chinese herbal medicines against S. iniae in vitro

注：“R”.低度敏感(0～10 mm); “I”.中度敏感(10～20 mm); “S”.高度敏感(>20 mm).表中數值為n=6平均值.

Note:“R”.low sensitivity (0～10 mm); “I”.moderately sensitive (10～20 mm); “S”.highly sensitive (>20 mm). The value in the table is the mean value(n=6).

表2 30種中草藥對海豚鏈球菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度 mg/mLTab.2 Minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC) of Chinese herbal medicines against S. iniae

3 討 論

3.1 中草藥提取液的體外抑菌效果分析

本研究發現，鱘魚源海豚鏈球菌對黃連、黃芩、連翹和丁香4種中草藥水提取物高度敏感，其中黃連、黃芩的研究結果與針對羅非魚源海豚鏈球菌的研究報道一致。張彬等[23]證實，羅非魚源海豚鏈球菌對黃連和黃芩高度敏感。但張彬等[23]發現，羅非魚源海豚鏈球菌對連翹僅僅表現為中度敏感，體外抑菌圈直徑為(14.67±0.82) mm。在本研究中，連翹對鱘魚源海豚鏈球菌體外抑菌圈直徑達到(23.53±1.93) mm，表明鱘魚源海豚鏈球菌對連翹水提物高度敏感。而吳穎瑞等[22]認為，羅非魚源海豚鏈球菌對黃連低度敏感，而黃芩、連翹對羅非魚海豚鏈球菌無抑菌效果。研究結果存在差異，這可能與供試菌株、供試藥液制備方法、供試藥液含量等方面不同有關。本研究中采取水煎煮法，配置的供試藥液質量濃度為1000 mg/mL；張彬等[23]同樣采取水煎煮法，但是配置的藥液質量濃度僅為480 mg/mL；吳穎瑞等[22]則采用95%乙醇回流提取，制備成浸膏狀，使用乙醇∶吐溫∶蒸餾水=1∶1∶8(體積比)的混合溶劑，配置成質量濃度為1000 mg/mL的供試藥液。目前提取中草藥的方法分為傳統提取方法(煎煮法、浸漬法、回流法、滲漉法等)和新型提取方法(超臨界流體萃取法、酶法、半仿生—酶法等)。中草藥成分復雜，采取不同提取方法對中草藥有效成分的提取率不同，進而表現為藥效不同[29]。

3.2 中草藥的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度差異及成分分析

張彬等[23-24]報道，黃連提取液對羅非魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度分別為3.75 mg/mL和7.50 mg/mL，這與本研究結果極為相似。本研究中，黃連提取液對鱘魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度最小，分別為1.95 mg/mL和3.90 mg/mL，表現出很好的抑菌、殺菌效果。中草藥的抑菌、殺菌效果與其含有的抗菌活性物質有關[30]。黃連中富含黃連堿、小檗堿、巴馬汀等活性成分，通過破壞細菌結構、抑制糖代謝達到抑菌的作用[31]。林媛等[32]證實，小檗堿對痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等細菌均表現出很好的抑菌效果，最小抑菌質量濃度均小于100 μg/mL。本研究中，黃芩和連翹同樣表現出較好的抑菌、殺菌效果，黃芩的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度分別為1.95 mg/mL和15.62 mg/mL，連翹的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度分別為3.90 mg/mL和7.81 mg/mL。同樣，黃芩和連翹針對羅非魚源海豚鏈球菌也表現出較好的抑菌、殺菌效果，張彬等[24]報道，黃芩和連翹提取液對羅非魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度相同，分別為7.50 mg/mL和15.00 mg/mL。研究發現，黃芩中主要活性成分黃酮類化合物，可以通過阻礙細菌體內的能量代謝途徑，實現廣譜抗菌作用[33]。連翹中含有抗菌活性的苯乙醇苷類化合物：6′-O-(順式-1，4-二羥基環己乙?；?-類葉升麻苷(1)；4-O-鼠李糖基-7S，8R-7′，8′-赤式—蒜芥茄脂素(2)；毛花球花苷A(3)；黃花馬纓丹苷 B(4)；石蠶苷B(5)；紫莖女貞苷J(6)；厚樸苷F(7)；松果菊苷(8)；異厚葉車前苷(9)。其中化合物1、6、8對金黃色葡萄球菌(ATCC 33591)生長具有中等強度抑制作用，最小抑菌質量濃度分別為8.00、16.00、4.00 μg/L，表現出消炎、抗病毒、抗氧化等多種藥理學作用[34]，這些藥理學作用與連翹的抗菌作用密切相關。目前尚未見關于丁香和秦皮對海豚鏈球菌抑菌、殺菌效果的報道。本研究發現，上述兩種中草藥水提物表現出與連翹相似的抑菌、殺菌效果，這同樣與其含有的活性成分密切相關。付振喜[35]研究發現，丁香主要活性成分為丁香精油，具有廣譜抗菌作用，其對青霉(Penicillium)、腐霉(Pythium)、交鏈孢(Alternaria)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度分別為3.125、1.56、6.25、6.25、3.125 μg/L，最小殺菌質量濃度分別為3.125、3.125、6.25、6.25、6.25 μg/L?，F代藥理學研究表明，秦皮具有抗病原微生物、抗炎等作用，姚麗芳等[36-37]報道，秦皮對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。翁遠超等[38]分析獲得，秦皮中主要已知化合物有16種，其中橄欖苦苷、plantainoside A、calceolariolside A、calceolariolside B和hydroxyframoside A對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有體外抑菌活性，且體外對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度分別為512、64、256、128、512 mg/L。此外，供試中草藥的產地、藥用部位、煎煮方法、采集季節、植物年齡、貯藏及炮制方法等因素也是影響中草藥藥效的重要因素[23]。

本研究證實，黃連、黃芩、連翹、丁香和秦皮對鱘魚源海豚鏈球菌均具有較好的抑菌、殺菌功效，其中以黃連功效最佳。但其對病原菌的抑菌機理目前尚未明確，有待于進一步證實，同時其實際臨床應用療效有待于進一步通過動物體內試驗加以比較、驗證。