miR-195 通過靶向調控SerpinA3促進胃癌細胞增殖、轉移及侵襲的實驗研究

羅文 李群芳 嚴超 蕭赪

湖南環境生物職業技術學院內科教研室（湖南衡陽421001）

胃癌（gastric cancer）是人類常見惡性腫瘤，很多胃癌發現時已經到了晚期，預后不良。microRNAs（miRNAs）是長度22 nt 的內源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調控轉錄及轉錄后基因表達。miRNA 先被RNA 聚合酶Ⅱ轉錄為1 000 nt 的初始轉錄本，再經過Drosha 酶剪切作用后形成長70 nt 的miRNA 前體，最后經Dicer 酶作用形成成熟的miRNA。miR-195 通過調控多種基因達到抑癌效果［1］。有報道稱，miR-195 通過靶向bcl-2 基因抑制喉癌細胞Hep-2 增殖，加速凋亡［2］。miR-195在肺癌組織中低表達，與臨床病理參數相關［3］。絲氨酸蛋白酶抑制因子A 類3（serpin peptidase inhibitor clade A member 3，SerpinA3）主要存在于真核生物細胞，其表達與多種疾病的發生發展有關［4］。然而，關于miR-19、SerpinA3 與胃癌的關系尚不明確。本研究探討了miR-195、SerpinA3 與胃癌的關系，旨在研究胃癌癌變機制，為胃癌的診治、預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞株及儀器 人胃癌MGC803及NCI-N87 細胞系（上海生命科學研究所）。miR-195引物序列、miR-195 mimics、miR-NC 對照質粒（上海生命科學研究所）；含野生型和突變型SerpinA3序列的熒光素酶報告基因質粒（上海生工生物公司）；SerpinA3 一抗和二抗（Sigma 公司，美國）；RNA 提取試劑盒，轉染試劑盒（武漢博士德生物公司）；AnnexinV-FITC，MTT 試劑盒（武漢博士德生物公司）；熒光素酶檢測試劑盒（BioVision 公司，美國）；Transwell 小室、PCR 試劑盒（Sigma 公司，美國）；酶標儀（上海儀電分析儀器有限公司）；ABI 7900PCR 擴增儀（上海儀電分析儀器有限公司）；流式細胞計數儀CytoFLEX LX（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 細胞轉染、分組 使用RPMI-1640 培養基，37 ℃，5%CO2條件下傳代培養，定期換液。根據轉染不同分為：miR-NC 組（空質粒），miR-195-mimics組（模擬序列）。轉染后細胞繼續孵育48 h。

1.3 RT-PCR檢測miR-195 mRNA表達 利用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，測定RNA 濃度，將合格的總RNA 轉錄成cDNA，然后進行PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共，40 個循環。實時熒光定量PCR 結果采用2-ΔCt表示。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.4 MTT 實驗 將各組細胞接種于96 孔板中，細胞濃度調整為5×103個/孔，培養24 h，分別于培養后1、2、3、4、5 d 每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續培養4 h 后酶標儀測量OD值。細胞生長抑制率（IC）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.5 流式細胞術 各組細胞胰酶消化，離心，PBS洗滌3 遍，離心，PBS 重懸，室溫培養1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗滌3遍，加入10 μL PI避光條件下4 ℃孵育1 h。流式細胞儀測定Ex = 488 nm 處的熒光強度。

1.6 Transwell 小室實驗 用預冷不含血清的培養基稀釋Matrigel 基質膠，鋪于24 孔板上室內，紫外線殺菌，使用前加入少量無血清的培養基置孵育2 h 水化。接種細胞于24 孔板上室內，密度為6 × 104個/孔，下室加入RPMI-1640，孵育12 h，洗滌死亡懸浮細胞。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結晶紫染色10 min。95%乙醇4 ℃條件下下洗滌6 h，光學顯微鏡下評估5 個視野細胞侵襲情況，取平均值。

1.7 細胞劃痕實驗 在孔板背面用marker 筆劃兩條直線，接種細胞，無菌移液器槍頭在細胞區域沿著劃痕劃“-”字，顯微鏡下分析劃痕區細胞數量。

1.8 Western Blot 檢測SerpinA3 蛋白量表達 去除培養基，PBS 洗滌細胞，裂解液裂解細胞，冰浴30 min，40 ℃1 500 r/min離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL 待測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h，逐次鼠抗人SerpinA3 多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗。Bio-Rad 成像儀曝光成像，Image Lab Software 測定光密度。

1.9 熒光素酶實驗驗證miR-195 與SerpinA3 的靶向作用關系 按照試劑盒步驟將SerpinA3 野生型或突變型的熒光素酶報告基因質粒載體單獨轉入細胞，培養48 h 后去除培養液。PBS 洗滌3 遍，加入細胞裂解液。4 ℃振蕩10 min，40 ℃1 000 r/min離心3 min，取上清進行發光測定。

1.10 統計學方法 本實驗數據使用SPSS11.0軟件分析，計量資料（）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料使用（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關分析SerpinA3 蛋白及miRNA-195 表 達的相關性。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組miR-195 表達分析 miR-195-mimics 組細胞miR-195 水平高于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞miR-195 mRNA 水平Fig.1 Cell miR-195 mRNA levels in each group

2.2 miR-195 過表達對細胞增殖、凋亡的影響miR-195 mimics 組第1、2、3、4 天細胞活力低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖2A。

miR-195 mimics 組G1 細胞高于miR-NC 組，G2期、S 期細胞低于miR-NC 組，G2/S 期細胞比值低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 miR-195 過表達對細胞遷移、侵襲能力的影響 miR-195 mimics 組細胞劃痕距離大于miR-NC組（P＜0.05）。見圖3A。miR-195 mimics 組細胞侵襲數低于miR-NC 組（P＜0.05）。見圖3B。

2.4 過表達miR-195 對SerpinA3 蛋白的影響miR-195 mimics組細胞SerpinA3蛋白水平低于miRNC 組（P＜0.05），見圖4。Spearman 相關分析顯示，轉染miR-195 mimics前后細胞中miR-195 mRNA水平與SerpinA3蛋白含量負相關（r=-0.464，P＜0.01）。

圖2 miR-195 過表達對細胞增值、凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-195 overexpression on cell proliferation and apoptosis

2.5 miR-195 直接靶向作用于SerpinA3 熒光素酶實驗進一步驗證結果顯示，轉染野生型和突變型SerpinA3 序列質粒的細胞中熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05）；轉染miR-195 mimic 和野生型SerpinA3 序列質粒與單獨轉染野生型SerpinA3 序列質粒比較，熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01）；轉染miR-195 mimic 和突變型SerpinA3 序列質粒與單獨轉染突變型SerpinA3 序列質粒相比，熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。見圖5。上述結果表明miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。

3 討論

圖3 miR-195 對細胞遷移、侵襲能力的影響Fig.3 Effect of miR-195 overexpression on cell migration and invasion

圖4 過表達miR-195 對SerpinA3 蛋白的影響Fig.4 The Effect of Overexpression of miR-195 on SerpinA3 Protein

研究［5-6］表明，miRNAs 在腫瘤的發生發展中起到至關重要的作用。miR-195 基因位于17 號常染色體長臂［7］。研究［8］表明miR-195 乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肝癌等腫瘤組織中低表達，與腫瘤的侵襲、轉移有關。另外學者研究提示miR-195 在非小細胞肺癌組織中低表達，可以抑制細胞的遷移、轉移［9］。另外學者研究表明［10］，miR-195 在胃癌組織中同樣低表達，與淋巴結是否轉移有關。筆者研究表明，轉染miR-195 后的胃癌細胞系增殖、侵襲及遷移能力降低。轉染miR-195 后的胃癌細胞處于G1/G2 期增多，S 期降低，提示miR-195的過表達可使胃癌細胞停留于G1/G2 期。

圖5 miR-195 與SerpinA3 的靶向關系Fig.5 Target relationship between miR-195 and SerpinA3

絲氨酸蛋白酶抑制蛋白（Serpin）主要存在于真核生物細胞，可以抑制朊酶活性，而朊酶的主要作用是直接破壞細胞或組織的基底膜以及細胞外膜的結構和多種功能蛋白的表達，進而可表現促進癌細胞的浸潤與轉移的生物學效應，如基質金屬蛋白酶、組織蛋白酶在直腸癌細胞的侵襲和轉移行為中發揮不可替代的作用。SerpinA3 功能復雜，與多種疾病密切相關［11-13］。研究［14-15］表明，SerpinA3 在結腸癌組織高表達，與腫瘤臨床病理特征，如轉移、侵襲及轉移登密切相關。另外研究表明［15］，黑色素瘤組織中SerpinA3 高表達，且與腫瘤臨床病理特征，如轉移、侵襲及轉移登密切相關。本研究結果表明，轉染miR-195 mimics 后胃癌細胞中SerpinA3 蛋白水平降低，相關性分析表明，兩者呈負相關。熒光素酶實驗進一步驗證結果顯示，miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。分析原因可能與miR-195 下調SerpinA3 表達，進而調控胃癌細胞生物學行為，但機制尚需要進一步研究證實。

本次研究還存在不足之處，如未對其他靶基因與相關通路研究，今后對相關通路分析、驗證，希望為胃癌的診治提供思路。

總之，miR-195 可抑制胃癌惡性行為，其機制與下調SerpinA3 有關，為治療胃癌的診治提供新思路。