免疫印跡法檢測TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達在梅毒診斷中的應用評估

王欣俞，崔 凱，趙晉文，丁曉娜，王鑫琪，魏殿軍，張延海，高德祿，劉 朋，郭奕陽

（1. 河北燕達醫院檢驗科，河北廊坊 066251；2. 河北燕達醫學研究院，河北廊坊 066251；3. 河北醫科大學第四醫院檢驗科，石家莊 050000）

梅毒是由梅毒螺旋體（treponemia pallidum，TP）感染引起的，累及全身多器官的一種疾病，其傳播途徑主要是性傳播[1]。近年來梅毒的陽性檢出率隨著人口流動性增加及社會生活方式的改變而呈現不斷上升的趨勢[2]，特別是因為早期梅毒的病變組織，又增加了獲得性傳播人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的風險[3]。其診斷主要根據病史，臨床表現和實驗室血清學檢測。血清學檢測梅毒特異性抗體是目前國內外診斷梅毒的主要方法[4]，在梅毒診斷方面起到重要作用[5]。血清學檢測主要分為兩類：第1類為非TP抗原血清試驗，常用方法包括快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）、性病研究實驗室試驗（VDRL）、甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等；第2類為TP抗原血清試驗，主要有梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA）、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）、熒光密螺旋體抗體吸附試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫層析法、化學發光法及免疫印跡法等（WB）[6]。在梅毒血清學檢測方法中，不同檢測方法學反應性結果存在不一致性。梅毒螺旋體抗體免疫印跡試驗（treponema pallidum-western blot，TP- WB）采用大量高度純化的梅毒螺旋體抗原，是目前較為公認的梅毒特異性抗體確證方法[7]。本研究將梅毒血清學檢測初篩有反應性的臨床患者入組，擬評估免疫印跡法檢測TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達在梅毒診斷中的應用，研究結果為提高梅毒血清學診斷準確性提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性納入河北燕達醫院2018年6月～2019年6月28 417例使用化學發光微粒子免疫分析法（CMIA）篩查的梅毒血清樣本，選取檢測結果cutoff值S/CO比值＞15以及S/CO比值1～9患者樣本178例為研究對象，其中男性86例，女性92例，平均年齡56.22±19.15歲。分組：A組34例標本，CMIA檢測有反應性，TPPA陽性且RPR檢測陽性并伴有滴度；B組38例標本，CMIA檢測有反應性，cutoff值S/CO比值＞15，TPPA陽性，RPR檢測陰性；C組106例標本CMIA檢測有反應性，cutoff值S/CO比值1～9，TPPA均陽性，RPR檢測均陰性。梅毒感染診斷符合《中華人民共和國衛生行業標準-梅毒診斷（WS273-2018）》[8]。

1.2 試劑和儀器 CMIA檢測法使用的廠家配套試劑盒及ARCHITECT i2000儀器，購自美國雅培公司； TPPA檢測法使用原廠配套試劑，購自日本富士公司的瑞必歐株式會社；TP- WB檢測法使用原廠配套試劑盒，購自德國歐蒙公司。

1.3 方法 抽取梅毒篩查對象空腹靜脈血5ml，3 000r/min離心10min，血清樣本加樣，2～8℃保存。CMIA法檢測梅毒特異性抗體，儀器測得樣本發光值并計算反應物濃度，結果判讀標準：S/CO≥1為梅毒螺旋體抗體反應性，S/CO＜1為非反應性。RPR法檢測非特異性抗體；TPPA法檢測梅毒特異性抗體；TP-WB法檢測梅毒特異性抗體，該方法將含有TPN47，TmpA， TPN45，TPN17和TPN15抗原的硝酸纖維素膜測試條與30μl血清樣品一起溫育，然后與辣根過氧化物酶標記的對人IgG特異的二抗孵育。在添加TMB后，免疫復合物在條帶上可視化為暗帶。通過與截止對照條帶的強度比較來評估每個抗原條帶的強度。檢測膜條置于全自動免疫印跡儀EUROBlotMasterll上檢測，通過EUROLineScan軟件判讀結果，當五個診斷帶中至少兩條特異性抗原帶明確顯色，測試被判讀為陽性；一條特異性抗原帶明確顯色，測試被判讀為可疑。EUROLineScan軟件判讀結果標準為著色強度≥24判定為有反應性，儀器判讀檢測線性為24～255。

1.4 統計學分析 采用MetaboAnalyst 4.0 的Statistical Analysis 模塊進行數據的統計分析，具體步驟如下：樣本TPN47， TPN45，TPN17和TPN15及S/CO指標值以列的方式分別錄入，以逗號間隔的CSV格式文件上傳，然后進行數據完整性檢查，樣本經標準化數據轉換及數據正態化后進行相關分析及主成分聚類分析。其中，相關分析采用Pearson r 距離法；數據分類可視化采用主成分分析法（principal component analysis， PCA）。采用Medcalc軟件對CMIA 法S/CO做特征曲線(ROC曲線)統計分析，計算曲線下面積，確定 CMIA 法對梅毒診斷效能最大時的 S/CO最佳截斷點。不同診斷方法計數資料的比較采用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP-WB法、CMIA法及TPPA法試驗檢測梅毒抗體結果 178例受檢者中，TPPA法檢測結果梅毒陽性共168 例，陽性檢出率為94.4%；TP-WB法檢測結果梅毒陽性 78例，陽性率為43.8%，兩種檢測方法陽性率差異有統計學意義（χ2=104.2，P＜0.01），TP-WB法的靈敏度為 68.29%，特異度為90.91%。以TP-WB結果為參照，繪制ROC曲線，見圖1。統計結果表明，當 CMIA 法測得的 S/CO 截斷值為 6.79時，敏感度為 79.41%，特異度為 96.05%，此時曲線下面積最大為 0.911，即6.79 為 CMIA 法的最佳診斷截斷值。

圖1 S/CO 比值ROC曲線分析

圖2 TP-WB法四種抗體著色強度和S/CO比值相關性

2.2 TP-WB檢測TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達與CMIA法相關性分析 TP-WB法檢測TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達著色強度和CMIA法S/CO比值相關性分析結果見圖2。同一樣本TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達水平與S/CO比值均呈正相關（P ＜0.05），四種抗體表達水平與S/CO比值相關系數r分別為0.87，0.81，0.87及0.76。

2.3 TP-WB法著色強度分組的結果分析 按照TP-WB法讀取著色強度值將178例樣本進行分析， A組34例著色強度50～170，B組38例著色強度24～90，C組106例著色強度24～50，組別及主成分分析聚類結果見表1及圖3。當第一主成分為90.6%，第二主成分為3.9%時，將三組分別聚類分開。分組因子貢獻分析見圖4所示，5個分組因子夾角為銳角，貢獻率從高到低依次為TPN15，TPN45，TPN17，TPN47和S/CO比 值。A組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均反應性且著色強度高數值，顯示評價方法和比對方法陽性符合率、總符合率為100%，具有高度一致性。B組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體陽性率均減少，分別為92.1%，65.8%，86.8%和36.8%。TPN17和TPN47抗體陽性率顯著降低（P＜0.05）。C組，TPN15和TPN17抗體表達為主。TP-WB法檢測30例結果反應性（檢測出6例結果陽性，24例結果可疑陽性），76例結果陰性。TPPA法復驗，檢測出96例結果1:80陽性，10例結果陰性（TP-WB確證時，2例結果判定可疑）；TPPA與TP-WB法相比，顯示陽性符合率29.2%。

表1 CMIA,TPPA,RPR,TP-WB及其抗體表達檢測結果

圖3 TP-WB免疫印跡法樣本著色強度分組主成分聚類結果

圖4 TP-WB免疫印跡法樣本著色強度分組因子貢獻分析

3 討論

近年來，梅毒作為嚴重威脅公共健康的傳染性疾病之一[9-10]，具有極強的侵襲性，它通過黏附、定植、穿過組織屏障、累及全身各器官[11]。據報道，無癥狀梅毒的發生率高達64.6%以上[12]，盡管梅毒的發現和診治已有數十年的歷史，但是初期梅毒確診和晚期梅毒治療仍具有挑戰性[13]。TP侵入機體后可誘導產生針對其不同抗原成分的抗體，主要包括抗心磷脂抗體和抗TP特異性抗體，是臨床血清學檢驗診斷是否攜帶梅毒的基礎。TP蛋白是梅毒感染的重要因素，在感染梅毒時，檢測患者血清中的TP蛋白對梅毒的診斷具有重要價值[14].TP外膜蛋白是免疫的主要靶點，相關研究已發現9種具有免疫活性的蛋白，即TPN15，TPN17，TPN33，TPN37，TPN39，TPN43，TPN45，TPN47和TPN97，而其中的TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達水平被認為在梅毒的致病與診斷中起重要作用[15]。

TP是迄今為止無法在體外培養的病原微生物,感染后其表面的膜蛋白對宿主的固有免疫系統具有很強的調控作用,因此被認為是 TP重要的毒力因子[16-17]。隨著醫學分子生物學技術的發展，TP膜蛋白的相關研究報道及應用不斷涌現[18]。在蛋白質印跡診斷測試中TPN45脂蛋白（TmpA; tp0768基因產物）和嵌合大腸埃希菌表達TPN15，TPN17，TP44.5和TPN47抗原（Meridian Life Science，Inc.，Memphis，Tennessee USA）作為免疫原性抗原的組合，被證實對獲得性梅毒具有高度敏感度和特異度[19]。其中TPN47，TPN17，TPN15以及TmpA脂蛋白具有強大的前炎癥活性，與TP引起的梅毒免疫反應密切相關[20]。KUBANOV等[19]報道TPN15和TPN17免疫原性抗原是關鍵成員，在梅毒感染期間誘導高抗體反應并且不與來自患有其他螺旋體病的患者的血清交叉反應。CHAN等[21]提出TPN17在菌體外膜表面的分布具有隨意性的特點。它可能通過激活細胞間黏附分子1（ICAM-1），E-選擇素和單核細胞趨化蛋白-1的表達，在蛋白質配體結合，密螺旋體膜結構維持[22]或梅毒發病機制中起作用。另一種強免疫原TPN47，具有較強的免疫原性和反應性，通過刺激微血管內皮細胞合成細胞間黏附分子并誘導血管細胞黏附分子在宿主-病原體相互作用中發揮作用[19，23]。

本項研究中顯示活動性梅毒患者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均具反應性且EUROLineScan軟件判讀結果著色強度數值高反應性，與梅毒活動進展呈正相關性；CMIA檢測S/CO值＞15時，梅毒抗體單陽者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47陽性率均減少，其中TPN17和TPN47抗體陽性率顯著降低（P＜0.05）；CMIA檢測S/CO值在1～9之間反應性結果時，通過免疫印跡檢測確認顯示陽性及可疑患者中TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體的表達明顯減少且反應曲線著色強度均呈低水平。CMIA，TPPA與WB-Tp之間檢測結果不一致，其陽性符合率僅為29.2%，并且臨床最終判定結果陽性占20%（6/30），可疑陽性結果占80%（24/30）。

綜上所述，基于重組脂蛋白技術的密螺旋體特異度檢測顯著改善了梅毒的診斷，為臨床實驗室提供血清學檢測確證的依據。本研究結果顯示，梅毒患者分期處于不同的階段時，梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達存在差異。當梅毒血清初篩檢測結果弱反應性以TPPA復核時，TPPA檢測結果并不能作為臨床確證的診斷，實驗室血清學確證方法應首選梅毒免疫印跡法進行確證。