2009～2018年北京協和醫院布魯菌感染的臨床與實驗室特點分析

劉文靜，孫宏莉，張小江，王 瑤，楊啟文，竇紅濤，王 賀，趙 穎，郭莉娜，劉亞麗，張 麗，肖 盟，徐英春

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科，北京 100730；2.北京市侵襲性真菌病機制研究與精準診斷重點實驗室，北京 100730）

布魯菌病是一種常見的動物源性疾病，感染對象包括家畜、野生動物和人，一般來說，動物是布魯菌的無癥狀攜帶者。人感染布魯菌病的潛伏期長短不一，一般是1～4周。因布魯菌寄生在巨噬細胞內，可通過局部淋巴結轉運至循環系統，進而通過網狀內皮系統的趨向性播散至全身，導致疾病的不同階段[1]。布魯菌病起病隱匿，可表現為廣泛多樣性的非特異臨床癥狀和體征，如發熱、盜汗、關節痛、肌痛、乏力、食欲缺乏、體重減輕和肝脾腫大等。并發癥可涉及多個器官和組織，可有局限病灶，兒童表現為相似的臨床表現[2]。引起人的感染發熱初期與瘧疾、傷寒等疾病容易混淆，給臨床診斷帶來極大挑戰，病史采集和體格檢查對于感染性疾病的診斷和經驗性治療是決定性的[3]。布魯菌感染急性期經規范治療多可治愈，若治療不及時或不規范可轉為慢性，不同區域布魯菌流行的特點略有不同[4]，為提高臨床醫生對該病的認識，減少誤診漏診，使患者得到及時正確的診斷治療，現將2009～2018年北京協和醫院布魯菌感染的臨床和實驗室特征分析如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集北京協和醫院檢驗科2009～2018年134例布魯菌感染患者送檢外周血自動化血培養（185）及組織（8）、骨髓（7）、腦脊液（3）、關節液（2）和玻璃體（1）等普通培養標本共206例。

1.2 試劑和儀器 血瓊脂平板、不含萬古霉素的巧克力瓊脂平板、中國藍瓊脂平板（英國Oxoid公司）；BACTEC? FX全自動血培養儀（美國BD公司）；BacT/ALERT 3D，氧化酶（法國生物梅里埃公司）；觸酶試劑（實驗室新鮮配制）；尿素微量生化反應管（杭州濱和微生物試劑有限公司）；布魯菌凝集試劑盒（法國生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 布魯菌培養：嚴格按照北京協和醫院檢驗科外周血自動化血培養及無菌標本病原微生物鑒定操作規程進行檢測。全部操作均在生物安全柜中進行。

1.3.2 布魯菌凝集實驗：按試劑說明書在反應卡孔內加入試劑R1（經孟加拉玫紅染色的滅活牛布魯菌）15μl與待檢血清15μl，用攪拌棒混勻，緩慢搖動反應卡4min，觀察凝集反應。凝集(包括弱凝集)為陽性，不凝集為布魯菌抗體陰性。

1.3.3 布魯菌屬陽性鑒定標準：37℃需氧或5～10ml/d1 CO2孵育24～48h后形成邊緣整齊、光滑、有折光性、直徑為1～2mm的菌落，鏡下形態典型沙灘樣，革蘭陰性小球桿菌，氧化酶、觸酶和快速脲酶實驗陽性，即可初步報告可疑布魯菌屬[5]。

2 結果

2.1 布魯菌感染的臨床特征 男性患者88例，女性患者46例，平均年齡48歲（1～78歲）。接觸史方面：50%患者曾生活在疫區，接觸牲畜、生牛羊肉及食用未滅菌奶制品等。臨床表現前三位的癥狀和體征為發熱（66例）、關節痛和／或肌肉痛伴乏力（23例）、心臟?。?0例）。另外還有頭痛、憋氣、納差、布魯菌病脊柱炎、淋巴結腫大、睪丸腫大、腦膜炎、腎炎、眼內炎及多器官受累等多種臨床表現。

2.2 布魯菌感染的科室分布 住院99例、門診62例、急診45例。分離前五位的科室為感染內科（49例）、急診科（34例）、普通內科（11例）、發熱門診（9例）、骨科（3例）。其他科室包括呼吸內科、免疫內科、神經內科、神經外科、心胸外科、兒科、腎內科、消化內科、血管外科、眼科和內分泌科，其中有少數患者轉診于兩個不同的科室，主要為急診科轉到血管外科和普內科各1例；胸外科轉外科ICU和血管外科各1例，內分泌科轉胸外科1例。

2.3 布魯菌培養陽性標本分析 布魯菌需氧血培養瓶陽性報警時間均值為88.12h（2～481h）。除外周血外，組織、骨髓、腦脊液、關節液、玻璃體等標本類型也有布魯菌的分離。134例布魯菌感染患者標本送檢情況為：外周血115例、組織4例、骨髓2例、腦脊液2例和玻璃體1例；部分患者同時送檢2種不同類型的標本，其中外周血+骨髓4例，外周血+其他組織3例，外周血+關節液2例，骨髓+腦脊液1例。206例送檢陽性標本中，外周血是重復送檢比率最高的標本類型為185例，提示部分患者重復送檢多套外周血陽性。

2.4 布魯菌培養與血清凝集實驗結果的一致性 83例疑似布魯菌感染患者同時進行了布魯菌培養和布魯菌凝集實驗，82例患者布魯菌培養和血清凝集實驗同時陽性，1例患者布魯菌培養陽性，血清凝集陰性。

2.5 2009～2018年北京協和醫院布魯菌陽性分離趨勢 見圖1。十年間，2015～2017年是布魯菌分離率最高的3年。

圖1 2009年～2018年布魯菌培養陽性分離例數趨勢

2.6 2009～2018年北京協和醫院布魯菌培養陽性例數隨季節分配情況 見圖2。4～7月是布魯菌培養陽性分離最高的季節。

圖2 2009～2018年北京協和醫院布魯菌陽性季節分配情況

2.7 布魯菌感染的用藥及轉歸 參考衛健委印發的《布魯氏菌病診療指南》[6]，134例患者中2例為隱性感染病例，其他均為確診病例。嚴格按照推薦用藥方案進行治療：一線藥物為多西環素聯合利福平或鏈霉素，二線藥物為多西環素聯合復方新諾明或妥布霉素，利福平聯合氟喹諾酮類。難治性病例加用氟喹諾酮類或三代頭孢菌素類。隱性感染病例是否需要治療目前尚無循證醫學證據，建議給予治療。急性期療程為6周，且外周血培養陰性方可考慮停藥，治療過程中需口服保肝護胃等藥物，定期復查血細胞計數、肝腎功能、紅細胞沉降率、超敏C反應蛋白、外周血培養等，警惕藥物副作用，如有進行性加重血細胞計數及肝腎功能異常時需停藥并及時就診；慢性期（病程超過6個月仍未痊愈）治療周期達半年甚至一年以上?？紤]到藥物的毒副作用，如利福平相關的骨髓抑制、肝功能損傷等，會暫緩使用或改為阿米卡星和/或左氧氟沙星進行治療。四環素類藥物中米諾環素抗菌活性最強，多西環素不良反應最少，用藥組合時也會權衡進行選擇。并發睪丸炎、腦膜炎、心內膜炎、血管炎、脊椎炎、其他器官或組織膿腫的病例，加用了三代頭孢菌素頭孢曲松。

除13例門急診患者確診后無后續診療記錄，2例患者因其他基礎疾病急劇惡化放棄治療外，其他117例均為治療有效，好轉或治愈。慢性布魯菌感染患者7例，1例因不規律用藥和食用未滅菌奶制品有關，3例久住疫區販賣養殖牲畜有關。特殊人群（1歲兒童）感染1例，鏈霉素和四環素治療有效。

3 討論

布魯菌的感染劑量很低（≤102個病原菌），感染主要發生在成年男性，與國內外文獻[4-5，7]報道一致，可能主要與職業有關，因感染大多發生在乳制品行業人員、獸醫、屠宰場工人、臨床和微生物學研究人員中，從事這些行業的較多為男性。感染的主要途徑為與感染動物組織的直接皮膚接觸（比如通過傷口和擦傷）、吸入含感染性顆粒的氣溶膠、意外接種（如噴霧劑或氣溶膠接種到眼、口和鼻）等。人與人的傳播有可能發生，但非常罕見。布魯菌感染的高發季節為4～7月與GUAN P[8]等報道的發病季節峰3～8月一致，與國內文獻報道北方流行的高峰為5月份一致[4]。2009年～2018年北京協和醫院布魯菌培養陽性分離情況， 除2009年和2018年陽性檢出僅為3例外，整體呈上升趨勢，可能與就診患者人群有很大關系，布魯菌感染患者是否來協和醫院就診有關。通過對布魯菌培養陽性患者科室分布和高發季節等數據的分析，應引起就診率高的相關科室醫師在相應季節時注意對布魯菌感染的鑒別診斷。

培養是布魯菌病實驗室診斷的金標準。由于布魯菌是高致病菌，陽性培養物的轉種、染色、進一步生化鑒定、分型、藥敏、PCR，質譜等試驗均有較高的實驗室感染風險，不建議一般的實驗室進行操作。急性布魯菌病培養陽性率（40%～90%）高于慢性、局限病灶和病情復雜的布魯菌?。?%～20%），骨髓培養比外周血培養陽性率高15%～20%，腦脊液布魯菌培養陽性率低（5%～30%）。血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板37℃，5%～10%（v/v） CO2孵育10天，若仍無菌生長，則報告陰性[9-10]。自動連續監測血培養系統，大部分細菌一周之內可以快速監測到細菌生長，沒有必要孵育超過10～14天[10]。但實際工作中為了同時捕獲一些其他非典型性病原體，往往將懷疑布魯菌感染的自動化培養延長至21天。布魯菌的準確診斷，極大依賴實驗室工作人員的經驗，由于布魯菌菌落形態的不特異性，當菌量比較少時，極易被當成污染菌。不同類型臨床標本的送檢極大依賴于臨床醫生的經驗，當高度懷疑布魯菌感染時應提高骨髓標本的送檢率，局限病灶時應考慮相應部位標本的送檢，以便提高陽性檢出率。

血清學試驗是實驗室診斷布魯菌病最常用的方法，可早期快速診斷[11]。布魯菌感染過程中，首先出現IgM抗體，接下來10～14天內出現IgG抗體。一般這些抗體和其他的免疫球蛋白的變化依賴于機體對治療的反應，在恢復期可觀察到抗體滴度逐步緩慢下降，若滴度持續較高則提示治療反應不佳，可能存在局部并發癥、慢性感染或復發，但15%～20%正在治療和痊愈的無癥狀患者也會出現抗體持續存在，目前尚無法解釋此現象[10]。治愈后患者抗體維持陽性滴度其意義尚未明確。血清學試驗使用的抗原通常來自于馬爾他布魯菌和流產布魯菌，犬布魯菌和綿羊布魯菌主要以粗糙型菌落存在，與其他菌種不存在交叉抗原[12]。血清凝集試驗無法區分抗體的類型，急性病例中應用較好，復雜和慢性病例中假陰性率高[5]。本文中有1例患者培養陽性，但血清凝集試驗陰性，可能與病情復雜多器官受累有關。酶免測定可區分IgM，IgG和IgA，尤其在慢性、局灶性和復發性布魯菌病具有較高的敏感度和特異度，被認為是篩選布魯菌血清抗體的好方法。

質譜技術近些年來也開始應用到布魯菌的鑒定中，但由于涉及到活菌的操作一定要注意生物安全，有報道指出質譜將羊布魯菌錯誤的鑒定為人蒼白桿菌[13]，可能與其建庫有關，所以警示實驗室人員不能過度依賴新興技術，對于特殊病原菌尚需涂片染色、生化反應等傳統技術進行復核。

8歲以下兒童及孕婦特殊人群治療可選用利福平聯合復方新諾明治療。妊娠12周內選用三代頭孢菌素類聯合復方新諾明治療。本研究中1歲兒童布魯菌感染患者用鏈霉素和四環素治療有效，值得借鑒。布魯菌對四環素、利福平和氨基糖甙類抗生素罕有耐藥，聯合藥物治療比單一藥物治療可減少復發，使用喹諾酮類和廣譜頭孢菌素的治療方案有較高的復發率，盡管體外藥敏提示有較好的MIC[14]，但本文尚未發現這樣的規律。實驗室高風險暴露后的預防治療（四環素和利福平治療3～6周）問題還存在爭議，暴露后的管理指南是經驗性的指南[15-16]，然而暴露后還是建議采集基礎水平時的血液標本，每周監測，直至6個月，同時在0，2，4，6和24周分別進行血清學監測。

盡管巴氏消毒法、紫外線照射、酸液、多種防腐劑和消毒劑可殺死布魯菌，但它能在多種環境中存活一段較長的時間，如在土壤中存活10年，在流產胎兒中可存活11周，在牛糞便中可存活17周，在牛奶和冰淇淋中約存活3周，在新鮮奶酪中可存活數月[17]。所以一定要加強布魯菌病的流行病學調查和宣傳教育，尤其是在疫區，避免布魯菌病的高發和傳播，建議采用多種方法綜合診斷布魯菌病，但一定要注意生物安全。

本文不足之處，由于北京協和醫院為全國疑難病診治中心，難以通過籍貫判斷患者為流動或常駐人群，難以區分不同區域患者疾病特點是否不同。部分患者為門急診患者，用藥及轉歸情況不詳。如果能夠完善布魯菌病確診的大致時間、不同期不同方法的陽性檢出率、誤診的幾率等可為臨床布魯菌病的診治提供更加完善的信息。