復合銀離子絡合技術在脂質分離分析中的應用

俞喜娜 崔益瑋 戴志遠 沈 清，2*

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室 杭州 310012

2 大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心 大連 116034）

脂質是一類難溶于水，較易溶于非極性溶劑的生物有機分子。細胞中脂質分子可大致分為3大類：非極性脂質（包括膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯）、極性脂質（包括磷脂類、鞘脂類和糖脂類）以及脂質代謝物（指脂質合成或水解過程中產生的物質）。目前，市面上常見的各類脂質營養素在食品相關領域應用廣泛，主要包括：長碳鏈多不飽和脂肪酸，如ARA（花生四烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、EPA（二十二碳五烯酸）、亞油酸、亞麻酸、生育酚和生育三烯酚、植物甾醇、角鯊烷、磷脂、磷脂酰膽堿、中碳鏈三甘油酯（MCT）等。

復合銀離子技術是基于銀離子與不飽和有機物碳碳雙鍵絡合反應的分離方法，而且雙鍵越多，絡合作用越強，形成的絡合物越穩定，在高度不飽和物的分離中具有重要作用，適用于組成成分復雜、回收率要求較高的場所。該技術擁有較強的選擇性和重現性，且操作簡單、快速，可以很好地改進傳統的分離分析技術，為人們開辟了嶄新的研究方向。鑒于有關復合銀離子在脂質分離分析中系統性研究的文獻有限，本文概述銀離子與脂質絡合機理、銀離子提取脂質的方法以及銀離子在不同生物樣品中的應用的最新研究進展，并對其現存問題及發展前景進行分析，旨在為復合銀離子技術的開發利用提供理論依據。

1 脂質的功能與分析方法

1.1 國內外脂質消費市場

以在保健食品、藥品等行業被廣泛應用的魚油為例，分析國內外脂質的消費市場。魚油主要成分為ω-3脂肪酸，是一種多不飽和脂肪酸[1]。魚油中的EPA和DHA是人體中不可缺乏的物質，能夠預防血脂升高以及心血管疾病，防止老年癡呆癥、血栓等的形成，然而人類自身無法合成[2]。目前魚油主要用于水產以及禽畜飼料，作為營養添加劑使用。據國際漁業協會報道，在國際粗魚油總產量中，僅20%～30%被用于生產各種保健食品、藥品，大量的粗魚油被作為海產養殖業的飼料添加劑。世界各國對魚油食品開發都非常重視，日本以及歐美發達國家對魚油保健品的研究起步較早，魚油加工產業鏈較為完善，魚油保健品的消費水平也較高。據美國F&S公司發布的調研報告顯示：從2002年至今，國際魚油市場規模以每年8%的速度增長。2004年，魚油及其制成品的全球市場銷售額為19.4億美元，到2005年增長到24億美元，2007年已接近或超過30億美元。而我國的魚油加工業發展也比較迅速，2014年我國魚油原料共出口2.9萬t，1.3億美元[3]，但就國內魚油保健品的年銷售額約在37億元左右，其中國外品牌產品約30億元而言，我國魚油保健品的市場占有率較低，基本被國外的魚油產品所壟斷，我國的當務之急是提高魚油中EPA、DHA的含量和純度。

1.2 脂質的營養保健功能

脂質結構的多樣性賦予了脂質多種重要的生物功能，它不僅參與調節多種生命活動，而且脂質的異常代謝還與某些疾病，如腦損傷[4]、肝炎[5]、動脈硬化癥[6]、糖尿病[7]、肥胖癥[8]、冠心病[9]、阿爾茨海默病[10]（Alzheimer disease，AD）、帕金森癥[11]以及腫瘤[12]發生發展密切相關。脂質的營養保健功能主要體現在以下幾個方面：（1）細胞膜的重要組成部分，是連接極性物質和非極性物質的重要橋梁；（2）細胞和組織的重要結構單元和機體信號物質，以及提供能量的重要來源（3）脂代謝紊亂將導致許多消化系統疾??；（4）脂質在神經系統中履行了多重專一性功能[13]；（5）脂質構成異?？赡軐е履遗葸\輸混亂；（6）細胞膜多不飽和脂肪酸水平隨年齡增大而趨衰減，可能導致認知功能的損害和記憶衰退；（7）脂質代謝紊亂積累到一定程度可導致機體的病理變化，影響血液循環系統正常生理活動。

不飽和度高的脂質中應用較為廣泛的有ARA、DHA、EPA以及亞油酸、亞麻酸。ARA能夠促進腦部和神經發育，改善記憶力，預防心血管疾病和癌癥。DHA還具有健腦明目，預防心血管病和癌癥，抗炎，抑制過敏作用。EPA具有降低膽固醇和甘三酯的含量，降低血液黏稠度，增進血液循環，消除疲勞的作用。亞油酸具有抑制腫瘤生長，減少粥樣硬化危險等作用。亞麻酸具有預防心腦血管疾病，降血脂、血壓，抑制癌癥的發生和轉移，抗衰老，增強智力等作用。ω-3脂肪酸可促進副腦的發育和生長，防止風濕性關節炎和冠心病、高血壓等[14]。

1.3 脂質結構及目前常規分離分析方法

脂質包括多種多樣的分子，其特點是主要由碳和氫兩種元素以非極性的共價鍵組成。通常根據脂質的主要組成成分分為：簡單脂質、復合脂質、衍生脂質、不皂化脂類。簡單脂質是脂肪酸與各種不同的醇類形成的酯，簡單脂質包括?；视王ズ拖?。復合脂質（Complex lipids）即含有其它化學基團的脂肪酸酯，體內主要含磷脂和糖脂兩種復合脂質。衍生脂質主要包括脂肪酸及其衍生物前列腺素和長鏈脂肪醇。不皂化的脂質是一類不含脂肪酸的脂質，主要有類萜及類固醇。

脂質的研究技術主要包括脂質的提取、分離、分析鑒定等。近年來對脂質組學分析方法的研究主要有以下幾個方面：（1）目標脂質組學，即針對某幾類脂質分子進行特定分析；（2）脂質輪廓分析，即全面地分析生物樣品內可能含有的脂質類化合物；（3）成像分析，即通過可視化的方法檢測生物組織或切片內不同脂質化合物的分布情況[15]。目前已建立的脂質研究方法有很多，主要有薄層色譜法（Thin-layer chromatography，TLC）、氣相色譜質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、軟電離質譜技術、“鳥槍法”和核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）等。其中軟電離質譜技術包括基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）法和電噴霧電離質譜（Elec trospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）法[16]。

薄層色譜法是最早應用的方法，也是最簡單的脂質分離方法。它的優點是比較直觀、快捷，分離效率較好且相對較為經濟。其缺點是只能分析揮發性的有機化合物，不揮發性的化合物用此法之前需進行水解或衍生化，而且需要的樣品量比較大，測定靈敏度和分辨率都比較低，TLC板上面的斑點在切除過程中易發生不飽和脂類氧化，破壞部分脂類結構，這些缺點限制了TLC在復雜的脂質分子上的深入應用。

氣相色譜質譜聯用適用于檢測分子質量小于500 u的脂質分子[17]，具有良好的分離效率且價格便宜。缺點是實際分析中測定的定酯化的脂肪酸脂質sn-1、sn-2?；坏闹舅徭湹奈稽c信息在測定過程中丟失，且樣品衍生化處理過程不僅耗費時間，還需要大量樣品，并易引起樣品變化，因此其在分析較為簡單的脂肪酸上應用較多。

軟電離質譜技術較為成熟，其特征是可使生物分子在無碎片斷裂的情況下進行分離。優點一是可不經過衍生化而直接對高分子量和不揮發性的混合物進行檢測；二是被分析物種的碎片少，利于對樣品混合物的解析。電噴霧電離質譜是脂質分析中應用最多的軟電離質譜法，該法通過正離子或負離子掃描得到生物樣本中脂質的全譜來進行定量分析脂質。此方法前處理比較簡單，靈敏度高，用時短且所需樣品量少，適用于大多數脂質的定量分析。其缺點是分析豐度較低的脂質較為困難，且用該法須加入不揮發性的Li+作為緩沖劑，易導致離子源污染，使質譜儀的使用壽命縮短?；|輔助激光解吸附電離飛行時間質譜在組織切片的脂質分析中應用較多，其基本原理是將目的樣品混合或涂上固體基質，便會出現特殊的吸收峰，這種方法的優勢在于不需要對酶類進行純化處理[18-21]。

“鳥槍法”在電噴霧電離質譜技術基礎上進行了改進，其原理主要是源內分離（Intra source separation），即根據脂質分子在不同pH值條件下有不同的帶電傾向，通過調整樣品的pH值，改變脂質分子的離子化傾向，并結合ESI正、負離子檢測模式的切換，達到離子化過程中分開檢測不同脂質分子的目的[22]。鳥槍法樣品無需預分離即可直接質譜進樣，操作簡單快捷，靈敏度高，結果穩定可靠。

2 銀離子與脂質絡合原理

銀離子絡合萃取法是基于銀離子與不飽和有機物碳碳雙鍵絡合反應的分離方法，具有較強的選擇性，然而其適應范圍比較窄。

Ag是IB族元素，外圍電子構型為4d105s1，易失去電子而呈現+1價氧化態。目前對于銀離子與碳碳雙鍵成鍵的解釋，普遍采用Dewar-Chatt-Duncan-son模型（DCD模型）。此模型認為銀離子與碳碳雙鍵的成鍵包括以下兩個方面：一方面是碳碳雙鍵向銀離子提供電子，即碳碳雙鍵π軌道與銀離子的5s空軌道形成σ鍵；另一方面銀離子向碳碳雙鍵的π*軌道反饋電子，即銀離子的4d軌道與碳碳雙鍵的π*反鍵軌道重疊，由銀離子的4d軌道向碳碳雙鍵的π*反鍵軌道流入電子，從而形成π鍵。

碳碳雙鍵的π鍵給電子的能力較弱，不易形成穩定配合物，由于反饋π鍵和σ配位鍵的成鍵作用，銀離子與碳碳雙鍵配合物得以穩定存在。作為過渡金屬元素，失去5s1這一外層電子后，正一價的銀離子具有d10的電子構型，從而與碳碳雙鍵形成非常穩定的配合物[23]。

3 基于銀離子絡合的方法

3.1 銀離子液液萃取

銀離子溶液液液萃取的選擇性較強，液液萃取根據相似相溶原理，依目的物的極性不同選擇適宜的溶劑，有不同極性的溶劑可供選擇，例如：石油醚這類非極性溶劑，水這類強極性的廉價溶劑，因此可解決很多實際問題，且萃取過程中的選擇性較好，效率高。另外銀離子溶液液液萃取可以得到常規技術難以得到的高純度產品，絡合反應條件較為溫和，分離簡單，為工業生產提供了一定的理論依據。

邱榕等[24]利用DHA乙酯與銀離子絡合物的紫外光譜，觀察光譜特征峰在絡合前、后的移動規律，研究了銀離子絡合物萃取DHA乙酯的絡合機理，發現與絡合前相比較，DHA乙酯與銀離子絡合物的最高占據軌道和最低空軌道之間相對能量差變大，位于絡合物外層的價電子能級間距離增大，電子躍遷需要更多的能量。陳鈞等[25]研究了用銀離子絡合法萃取典型不飽和有機物的一般規律和用此法萃取高純度濃縮魚油中的活性成分，結果顯示在有機物碳原子數與雙鍵數（或大π鍵數）之比小于等于6且無空間位阻的情況下，絡合萃取的概率較高，銀離子絡合法可較好地分離魚油中航的活性成分。張磊等[26]研究了銀離子絡合萃取蝦青素的工藝條件，發現萃取劑極性、萃取溫度和Ag+對蝦青素的萃取有較大影響，結果表明0℃時，用含飽和Ag+的甲醇∶水（9∶1，體積比）溶劑萃取含60%蝦青素的石油醚提取液，蝦青素純度提高至74%，回收率為92%。Dillon等[27]使用銀硫醇固定相對單-，二-和三-甘油酯進行高效液相色譜分析，研究表明，這種方法可以從單一色譜圖得到關于脂肪質量（不飽和度，反式脂肪酸）的基本信息，銀在固定相上是共價鍵合的復合物，這大大提高了HPLC柱的穩定性和耐久性以及分離結果的一致性。Kubota等[28]使用微孔疏水性中空纖維膜提取器，用硝酸銀水溶液進行多不飽和脂肪酸的乙酯如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的溶劑萃取，結果顯示滲透速率通過中空纖維的內側和外側的膜和層狀邊界層的擴散來控制。Teramoto等[29]研究了利用硝酸銀溶液從不同有機溶劑中提取多不飽和脂肪酸（PUFA），發現隨著溫度的降低，多不飽和脂肪酸乙酯在硝酸銀萃取相和溶于庚烷的有機相之間的分布比顯著增加。

3.2 銀離子固相萃取

不同于一般的氣相色譜定量檢測反式脂肪酸，檢測對象局限于植物油、乳品和嬰幼兒食品而不適用于含有動物油脂的食品，銀離子固相萃取擴大反式脂肪酸國標方法的適用范圍，提高了食品中反式脂肪酸檢測的科學性，具有較高的穩定性和精密性，且操作簡單、快速，有較好的重現性，對環境造成的污染也較小。

王濤等[30]研究了銀離子固相萃取結合氣相色譜對食品中反式脂肪酸的檢測效果，結果表明此方法具有較高的靈敏度和較好的分離效果，可避免順式和反式脂肪酸干擾，在肉類、乳類等制品中有較好的適用性，且得到的反式脂肪酸的含量更加準確。李蕊等[31]利用銀離子固相萃取結合氣相色譜分離了亞油酸、亞麻酸、反式脂肪酸，并檢測了乳脂肪中含有的反式脂肪酸，發現該方法既能準確檢測樣品中反式C18：1、C18：2的含量，也能測定反式C18：3含量。李冰寧等[32]用銀漬硅膠固相萃取柱離線凈化，程序升溫進樣-氣相色譜-氫火焰離子化檢測器的方法對巧克力中的飽和烷烴礦物油進行了定量分析，發現此方法的檢出限低，適用于巧克力中MOSH的測定，能很好的檢測巧克力中礦物油的污染情況。Christie等[33]用銀離子柱通過高效液相色譜分離三?；视偷姆肿臃N類，該試驗在銀離子柱上獲得了優異的分辨率，不會使銀離子成分被污染，同時色譜柱穩定，活性保持時間較長。Dreiucker等[34]使用銀離子固相萃取，然后以選擇的離子監測（SIM）模式運行的GC/EIMS進行了全面分析和比較了養殖駱駝、駝鹿和牛與一個人乳樣品，結果表明，人乳的反式脂肪酸和支鏈脂肪酸的含量較低，此方法可能有助于建立更全面的數據庫。

3.3 銀離子流動注射純化

銀離子流動注射純化大致有以下幾個優點：所需要的儀器設備結構較簡單，操作簡便易于連續分析，精密度較高，試劑用量少且有較大的適用性，可以完成復雜的分離萃取操作[35]。

Shanmugam等[36]在10℃條件下，在1.59mm微流體系統和65mL批量攪拌反應器中利用50%的硝酸銀溶液從18/12的原魚油中液液提取EPA/DHA，結果發現在這種微型接觸系統中所觀察到的流動模式與之前在這項方法上的研究結果存在顯著不同，分層流域系統的存在可能會導致每個階段不同的間隙速度，從而在有機相和水相的停留時間內產生意想不到的差異。

3.4 銀離子分子篩

分子篩是近幾年來出現的一門新興分離技術，分子篩具有網狀多孔結構，因此具有較高的吸附容量，而且還具有分子選擇吸附的性能，在高溫高壓下可將分子直徑較大的氣體分子強制壓入銀離子分子篩中。利用銀離子來調節分子篩吸附劑的吸附性能力，因為雙鍵數目多，與銀離子結合的能力就越強，而且硝酸銀的濃度對修飾反應的影響最小。

郝六平[37]在超臨界條件下用銀離子修飾的13X分子篩分離魚油中的DHA和EPA單組分，研究了壓力、溫度和魚油的流量對純度的影響，結果表明運用此方法將EPA和DHA的純度分別從20.4%和12.7%提高到88.4%和84.3%，收率分別為46.0%和35.5%。Ecknig等[38]分別對鉀離子和銀離子在分子篩腔內分步交換鈉離子的不同選擇性制備了X型分子篩，并對石蠟烯烴的選擇性進行了研究，選擇了最合適的分子篩用于計量石油內的成分。

4 復合銀離子絡合技術的應用

4.1 動物油脂

目前常見的銀離子分離動物性油脂有魚油這類海洋性哺乳動物油和乳類脂肪。魚油中所含的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸有很多對人體有益的生理活性，因而成為研究熱點。動物油脂的脂肪酸種類較多，含有大量長鏈多不飽和脂肪酸。

江莉莉等[39]通過響應面優化法優化銀離子絡合法提取魚油乙酯中EPA及DHA的最佳工藝，結果顯示，硝酸銀的濃度、料液比、解離溫度與轉移率存在顯著的相關性，最佳工藝條件為硝酸銀濃度4.9moI/L，絡合溫度0℃，料液比 1∶3.76，解離溫度51℃，解離時間30min，EPA和DHA的最高理論轉移率為62.8%。魯仲輝等[40]采用了尿素脂肪酸包合結合銀離子硅膠色譜技術分離以獲得高純度蠶蛹α-亞麻酸，結果顯示，脂肪酸/尿素質量比對包合效果的影響最重要。劉卓華等[41]利用硝酸銀絡合法濃縮金槍魚魚油混合脂肪酸中的多不飽和脂肪酸，結果表明在攪拌時間為60min，硝酸銀濃度為4mol/L條件下得率為18.03%，其中含有EPA和DHA質量分數為9.78%和86.07%。張金廷[42]編寫的脂肪酸加工手冊中寫到利用硝酸銀絡合法處理金槍魚眼窩的脂肪酸乙酯所得到的乙酯純度較高。Adlof等[43]采用飽和銀離子的XN1010樹脂柱分離多種魚油脂肪酸和酯樣品中高度不飽和的ω-3組分，在分離過程中添加丙酮腈，得到ω-3組分含量為82%～99%，運用此方法較為簡單快速。

4.2 植物油脂

利用銀離子絡合技術對植物油脂進行處理，不僅拓展了銀離子絡合技術在植物方面的應用領域，提升了植物油脂的附加價值，并解決了一些動物油脂中提取物資源稀缺的問題，實現了植物油脂中有益提取物的規?；a，也為研究植物油脂提取方法提供了新思路。

姚忠等[44]利用銀離子絡合技術絡合萃取山茶油中的角鯊烯，提高了角鯊烯的得率，而且銀離子絡合的高選擇性實現了分離操作的簡化，獲得了純度較高的角鯊烯。王昌祿等[45]以活化的銀化硅膠作為固定相，采用銀化硅膠柱層析提取紅花籽油中的亞油酸，解決了一般富集純化多不飽和脂肪酸方法中所存在的難以得到純度較高產物的問題。陳文利等[46]研究了銀離子絡合萃取法純化不飽和脂肪酸的方法，成功地分離了油脂中花生四烯酸等活性成分，結果表明經絡合萃取后，花生四烯酸的純度由15.14%提升到51.69%，收率為97.15%。陳曉等[47]探討了分離純化茄尼醇的方法，結果表明銀離子絡合萃取法是分離茄化醇的有效方法，當硝酸銀濃度為4mol/L，絡合2次后，得到的茄尼醇的純度為89.9%，收率為92.1%，且銀離子絡合的方法所需要的條件也較為簡單，降低了有機溶劑的消耗和茄尼醇提純的工業成本。葛雙雙等[48]利用銀離子絡合法分離純化了余甘子核仁油中α-亞麻酸，提高了α-亞麻酸的純度，結果顯示由于硝酸銀可重復利用，此方法降低了絡合工藝的操作成本，得到的產品不含銀離子，較為安全，該絡合反應在低溫條件中進行，更好地保證了α-亞麻酸的活性。

4.3 生物體內物質

銀離子具有電荷吸附作用，利用銀離子處理生物體內物質，具有方法簡單，重現性較好的特點，而且可通用于其它化合物的檢測。楊芹等[49]利用銀離子高效液相色譜-質譜法分析了血清中甘油三酯類化合物的組成，在小鼠血清的脂質提取物中鑒定出了66個甘油三脂類化合物和5個膽固醇類化合物，提供了TAG組成的具體信息，這是酶解法所做不到的。吳擁軍等[50]利用銀離子對蛋白質內的巰基的吸附作用，研究了銀離子選擇性電極測定血清中蛋白質這一方法，結果顯示此方法中的pH值和溫度對測定樣品中蛋白質含量的準確度存在很大影響。董春鳳等[51]研究了B族維生素聯合銀離子敷料治療心臟手術后切口脂肪液化的療效，還研究了其對肉芽組織生長的影響，研究表明銀離子敷料以及局部注射B族維生素使肉芽組織的形成加快，緩解了局部炎癥，使心臟手術后的切口脂肪液化部分愈合。

5 結論與展望

本文結合近幾年來銀離子絡合的相關文獻，綜述了關于復合銀離子絡合技術在脂質分離分析中的研究現狀。隨著我國經濟的發展，居民生活水平逐漸提高，對保健食品，例如：富含EPA和DHA的魚油的重視度越來越高，選擇合適的方式對脂質進行分離、分析日漸成為研究的熱點。

在銀離子液液萃取中，此法可獲得傳統方法所做不到的高純度樣品，而且反應條件相對較為溫和，不需要增加特殊設備的投入量，試驗過程中所用到的硝酸銀可回收重復利用。采用電解法回收，相對于常用的柱層析方法成本較低，且操作簡單，反應時間也較短，不需要加入很多有機溶劑，可適用于脂質大批量的提純，具有較為廣闊的應用前景[52]。同時也存在一些不足之處，例如：影響銀離子液液萃取的因素較多（料液比、溫度、硝酸銀的濃度等）。因此試驗設計要合理，而且銀離子遇到多烯的有機物或光容易被還原成銀，硝酸銀價格較貴，還具有腐蝕性。在銀離子固相萃取中，例如：對結構甘油三酯的同分異構體進行分離測定，此法可有效分離其同分異構體并準確定量，為結構脂質的性能評價和開發創新提供了一定的依據。銀離子固相萃取有較高的穩定性及精密度，而且性能穩定，同時避免飽和和順式脂肪酸對反式脂肪酸檢測的干擾。缺點是可能延長了實際操作時間，需根據實際情況進行選擇。銀離子流動注射純化和銀離子分子篩是新興的脂質分離技術，目前國內外關于這些技術的研究報道較少。

總而言之，復合銀離子絡合技術基于銀離子與碳碳雙鍵的絡合反應，擁有較好的選擇性，可提高分離產物的產量和純度，為脂質分離、分析提供了一個嶄新的視角，并為其開辟了一個較新的研究領域，具有較大的潛力及研究意義。