不同作物伴生對連作黃連產量和根際土壤微生物群落的影響

牛四坤

(山西藥科職業學院 藥學系，山西 太原 030031)

黃連(Coptischinensis)，又稱味連、雞爪連，屬毛茛科黃連屬多年生草本植物，其清熱燥濕、瀉火解毒功效顯著[1]。黃連是典型的忌連作藥用植物，連作常導致植株生長發育不良、病蟲害頻發，產量和品質大幅下降，嚴重制約黃連的產業化發展[2-3]。為減少黃連病害，藥農在生產中往往使用大量的化學農藥進行防治，不僅造成黃連藥材安全隱患，而且對土壤環境造成一定的污染[4]。近年來，人們對中藥材品質提出越來越高的要求，采用無公害手段緩解黃連連作障礙已成為當前亟待解決的關鍵問題之一[5]。

植物連作障礙的作用機制非常復雜，主要包括化感自毒作用、土壤生態環境災變等[6-7]。大量研究表明，由植物根際自毒物質介導的微生物群落結構失衡是造成連作障礙發生的主要因素，合理調控土壤微生物多樣性和群落結構是緩解連作障礙的關鍵所在[8-10]。近年來，利用生物間相生相克的原理合理安排作物間、輪、套作制度，已成為無公害緩解連作障礙的研究熱點之一[11]。相關研究表明，大蔥間作桔?？商岣咄寥兰毦鷶盗坎⒔档驼婢鷶盗?，緩解桔梗連作障礙[12]；生菜與菠菜輪作可提高土壤細菌的多樣性和豐富度，改善群落結構，緩解生菜連作障礙[13]；小麥與蠶豆間作可改善蠶豆根際土壤真菌的群落結構，提高多樣性和豐富度，降低鐮刀菌數量，緩解蠶豆連作障礙[14]。

伴生栽培是一種新型的栽培方式，不以收獲伴生植物為目的，主要是利用伴生植物的相生相克作用達到緩解連作障礙的效果[15]。伴生栽培與間、輪、套作的最大區別是不以收獲伴生植物為目的，從而減少了伴生作物對土壤水分、養分的爭奪，最大程度保障主栽作物的收益。楊瑞娟等[16]研究表明，大麥伴生栽培可提高番茄根區的土壤酶活性，改善微生物群落結構，降低根結線蟲發生率。徐偉慧[17]研究表明，小麥伴生可顯著提高連作條件下西瓜根際土壤微生物多樣性，改善群落結構，提高連作西瓜產量，降低枯萎病發病率。目前，中藥材連作障礙的緩解仍以化學手段為主，無公害緩解手段較為缺乏。伴生植物對中藥材植物連作障礙的緩解效果以及根際微生物群落結構的影響尚未見相關報道。因此，以黃連為試驗材料，研究了小麥、大蔥及黑麥草伴生栽培對連作黃連產量及發病率的影響，篩選出最佳的黃連伴生植物，并從根際微生物區系變化方面對其作用機制進行初探，以期為黃連連作障礙的無公害緩解提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自山西省運城市黃連種植基地，非黃連連作土壤基本理化性質為pH值7.15，EC值6.11，有機質、速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為46.52 g/kg、61.12 mg/kg、30.52 mg/kg、53.56 mg/kg；連作3 a土壤基本理化性質為pH值6.25，EC值6.83，有機質、速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為52.65 g/kg、52.65 mg/kg、26.82 mg/kg、50.06 mg/kg。供試黃連品種為黃連1號，購自安康市振興集團生物科技有限公司。供試3種伴生作物中，小麥品種為品資Ⅱ-5，由黑龍江農業科學院提供；大蔥品種為章丘大蔥，購自菏澤市三系大蔥良種有限公司；黑麥草品種為杰威，購自四川金種燎原種業科技有限責任公司。

1.2 試驗設計

試驗于2018年4月10日開始實施，采用小區完全隨機區組設計，共設5個處理，分別為頭茬黃連(CK1)、連作3 a黃連(CK2)、連作3 a黃連與小麥伴生栽培(T1)、連作3 a黃連與大蔥伴生栽培(T2)和連作3 a黃連與黑麥草伴生栽培(T3)。小區面積30 m2，平畦栽培，選取長勢、大小一致的黃連幼苗進行定植，株行距為10 cm×15 cm，每個處理3次重復。黃連幼苗定植后1周，于距離黃連幼苗植株6 cm處分別點播小麥、大蔥和黑麥草種子進行伴生處理。伴生植物株高長到30 cm左右時，人工留茬至10 cm左右，留茬的生長點繼續生長。整個試驗期間，各處理由專人進行統一的水肥管理，同時杜絕使用殺菌劑。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 產量 試驗結束后收獲時測定各處理的黃連產量，并進行換算。

1.3.2 發病率 調查整個試驗期間黃連的發病株數并計算發病率，發病率=發病株數/定植株數×100%。

1.3.3 土壤微生物數量、多樣性及群落結構

1.3.3.1 土壤取樣方法 于黃連發病盛期，用5點采樣法采集各處理的根際土壤，并保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于土壤微生物數量、多樣性及群落結構分析。

1.3.3.2 微生物數量測定 土壤細菌、真菌及放線菌數量測定采用稀釋平板法，培養基分別為牛肉膏蛋白胨培養基、孟加拉紅培養基和改良高氏一號培養基。

1.3.3.3 土壤微生物總DNA提取 采用 Fast DNA?SPIN Kit for Soil土壤總基因組提取試劑盒提取，用NanoDrop 2000紫外微量分光光度計測定DNA質量與濃度，采用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3.3.4 土壤細菌高通量測序 以土壤總DNA為模板，以Miseq測序平臺通用引物F341-R806對V3-V4區進行擴增。PCR反應體系為：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 U/μLTaq酶0.25 μL，DNA模板2 μL，正反向引物各0.5 μL，滅菌超純水12.75 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸6 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，用凝膠回收試劑盒回收目的產物，并根據回收DNA濃度，按照1∶1的比例等量進行混合，交送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.3.5 土壤真菌高通量測序 以土壤總DNA為模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTTGGTGAACCAGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-

C-3′)對真菌ITS區進行擴增。PCR反應體系與細菌反應體系一致。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸6 min。PCR產物回收參照細菌PCR擴增產物回收方法，回收產物按1∶1等量混合并進行測序。

1.4 數據統計及分析

采用QIIME軟件對原始測序數據進行去雜和優化，利用UPARES軟件對相似度在97%水平以上的有效數據進行生物信息統計分析，并基于細菌的Silva數據庫和真菌的Unite數據庫統計各樣本在不同分類學水平上的群落組成。利用MOTHUR軟件進行土壤微生物α多樣性分析，包括Chao1豐富度指數、Ace豐富度指數、Shannon指數和Simpson 指數。采用Excel 2007和SPSS 18.0分別進行數據整理作圖和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同作物伴生對連作黃連產量及發病率的影響

由圖1可以看出，連作顯著降低黃連產量、提高黃連發病率，而伴生栽培則可不同程度地緩解黃連連作障礙。與頭茬黃連(CK1)相比，連作3 a的黃連(CK2)產量降低43.29%，發病率提高59.92個百分點。伴生栽培可顯著提高連作黃連產量、降低黃連發病率。其中，T1、T2和T3處理黃連產量分別較CK2顯著提高53.31%、67.63%、42.92%，發病率分別較CK2顯著降低39.13、47.32、32.50個百分點。說明伴生栽培可顯著緩解黃連的連作障礙，其中，以大蔥伴生栽培緩解黃連連作障礙效果最佳。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同作物伴生對連作黃連根際微生物數量的影響

由表1可以看出，連作顯著降低黃連根際土壤細菌和放線菌含量，顯著提高真菌含量，最終使微生物總量顯著降低。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤微生物總量降低4.14%，其中，細菌和放線菌含量分別降低18.20%和21.20%，真菌含量提高60.37%，細菌/真菌和放線菌/真菌顯著降低，土壤由細菌型向真菌型轉化。

伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤的細菌、放線菌含量，顯著降低真菌含量。T1、T3處理微生物總量較CK2分別提高1.95%、0.49%，其中，細菌含量分別提高14.06%、9.08%，放線菌含量分別提高11.49%、5.52%，真菌含量分別降低21.67%、14.83%，細菌/真菌分別提高45.61%、28.07%，放線菌/真菌分別提高42.34%、23.89%。T2處理微生物總量雖然較CK2降低1.89%，但主要表現為真菌含量下降(30.61%)，細菌和放線菌含量則分別提高12.15%和10.80%。說明伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤的細菌和放線菌含量，降低真菌含量，促進連作土壤由真菌型向細菌型轉化，其中，以大蔥伴生栽培細菌/真菌和放線菌/真菌比值最高。

表1 不同作物伴生栽培對連作黃連根際微生物數量的影響Tab.1 Effects of companion planting with different crops on microorganisms quantity in rhizosphere soil of continuous cropping Coptis chinensis

注：同列不同小寫字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3 不同作物伴生對連作黃連根際微生物多樣性的影響

由表2可知，各處理的細菌、真菌覆蓋率均大于98%，說明本研究獲得的微生物序列覆蓋度較好，可用于細菌、真菌的多樣性和群落結構分析。Chao1指數、Ace指數、Shannon指數和Simpson指數是衡量微生物多樣性和豐富度的重要參數，其中，Chao1指數、Ace指數、Shannon指數越大表示樣本多樣性和豐富度越高，Simpson指數越高代表多樣性越低。連作顯著降低黃連根際土壤細菌和真菌的多樣性和豐富度。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤細菌Chao1指數、Ace指數、Shannon指數分別顯著降低11.65%、11.61%、21.63%，而Simpson指數提高30.77%；根際土壤真菌Chao1指數、Ace指數、Shannon指數分別顯著降低41.13%、41.00%、32.46%，Simpson指數提高83.33%。

伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤的細菌、真菌多樣性。與CK2相比，T1、T2、T3處理細菌Chao1指數分別提高7.84%、11.03%、4.57%，Ace指數分別提高7.53%、10.76%、4.35%，Shannon指數分別提高15.07%、21.53%、10.57%，Simpson指數分別降低13.24%、17.65%、7.35%；真菌Chao1指數分別提高40.81%、54.08%、30.32%，Ace指數分別提高40.39%、52.81%、29.73%，Shannon指數分別提高28.64%、36.41%、15.53%，Simpson指數分別降低27.27%、15.15%、36.36%。說明伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤細菌和真菌的多樣性與豐富度，其中，以大蔥伴生栽培多樣性和豐富度最高。

表2 不同作物伴生栽培對連作黃連根際微生物多樣性的影響Tab.2 Effects of companion planting with different crops on microorganisms diversity in rhizosphere soil of

注：同列不同小寫字母表示同一微生物種類不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level among different treatments of the same microbial species.

2.4 不同作物伴生對連作黃連根際微生物群落結構的影響

2.4.1 細菌群落結構 如圖2A所示，5種種植模式下，土壤優勢細菌在門水平上相同，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、消化螺旋桿菌門(Nitrospirae)和綠藻門(Cyanobacteria)，約占細菌總豐度的92.83%～96.08%。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門和消化螺旋桿菌門相對豐度顯著降低，而厚壁菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和綠灣菌門相對豐度顯著上升(P<0.05)。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門和消化螺旋桿菌門相對豐度，顯著降低厚壁菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和綠灣菌門相對豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、消化螺旋桿菌門相對豐度分別提高20.43%、54.68%、62.30%、100.00%，厚壁菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、綠灣菌門相對豐度分別降低33.81%、21.66%、20.11%、58.54%。

如圖2B所示，土壤優勢細菌屬在黃連5種種植模式根際土壤中表現一致，約占細菌總豐度的51.88%～53.37%，但是相對豐度存在較大差異。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤紅游動菌屬(Rhodoplanes)、韋榮球菌屬(Veillonella)和乳球菌屬(Lactococcus)相對豐度均顯著降低，而檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)、普氏菌屬(Prevotella)、消化螺菌屬(Nitrospira)和假單胞菌屬(Pseudomonas)則顯著升高(P<0.05)。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤紅游動菌屬、韋榮球菌屬和乳球菌屬相對豐度，顯著降低檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、消化螺菌屬和假單胞菌屬相對豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，紅游動菌屬、韋榮球菌屬、乳球菌屬相對豐度分別提高28.03%、35.34%、91.75%，檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、消化螺菌屬、假單胞菌屬相對豐度分別降低17.48%、40.68%、45.27%、60.78%、63.16%。

2.4.2 真菌群落結構 如圖2C所示，5種種植模式下，土壤優勢真菌門主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和纖毛亞門(Ciliophora)，約占真菌總豐度的81.43%～96.82%。連作顯著降低了黃連根際土壤子囊菌門、擔子菌門、壺菌門和球囊菌門的相對豐度，提高了接合菌門和纖毛亞門的相對豐度。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤子囊菌門、擔子菌門、壺菌門和球囊菌門的相對豐度，顯著降低接合菌門和纖毛亞門的相對豐度，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門相對豐度分別提高26.62%、39.20%、50.00%、117.11%，接合菌門和纖毛亞門相對豐度分別降低49.25%和22.13%。

A.細菌門水平相對豐度；B.細菌屬水平相對豐度；C.真菌門水平相對豐度；D.真菌屬水平相對豐度

如圖2D所示，黃連5種種植模式具有相同的優勢真菌屬，約占真菌總豐度的48.60%～59.52%，不同種植模式間相對豐度存在較大差異。連作顯著降低了黃連根際土壤支頂孢屬(Acremonium)、綠僵菌屬(Metarhizium)、柄孢殼屬(Zopfiella)和鏈孢菌屬(Alternaria)的相對豐度，提高了假霉樣真菌屬(Pseudallescheria)、被孢霉屬(Mortierella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和絲孢菌屬(Scedosporium)的相對豐度。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤支頂孢屬、綠僵菌屬、柄孢殼屬和鏈孢菌屬的相對豐度，顯著降低假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬和絲孢菌屬的相對豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，支頂孢屬、綠僵菌屬、柄孢殼屬、鏈孢菌屬相對豐度分別提高86.58%、36.19%、851.61%、54.55%，假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬、絲孢菌屬相對豐度分別降低32.62%、30.03%、44.95%、24.12%、42.11%。

2.5 土壤微生物菌群豐度與黃連發病率的相關性分析

由表3可知，與黃連發病率呈正相關的菌屬有12類，相關性由強到弱依次為假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、青霉屬、普氏菌屬、絲孢菌屬、消化螺菌屬、假單胞菌屬、浮霉菌屬和生絲微菌屬；與黃連發病率呈負相關的菌屬有7類，相關性由強到弱依次為紅游動菌屬、韋榮球菌屬、支頂孢屬、柄孢殼屬、乳球菌屬、綠僵菌屬和鏈孢菌屬。

表3 土壤微生物菌群豐度與黃連發病率的相關性Tab.3 Correlation between abundance of soil microbial community and disease incidence of Coptis chinensis

注：*表示在0.05水平上顯著相關，**表示在 0.01 水平上顯著相關。

Note:* indicates a significant correlation at 0.05 level; ** indicates a significant correlation at 0.01 level.

3 結論與討論

大量研究表明，連作會對植物的生長發育產生負面影響，顯著降低作物的產量和品質，提高作物發病率，而合理的栽培制度(如連作、輪作、套作等)可起到一定的緩解作用[3,7-8]。本研究發現，連作3 a的黃連產量較頭茬黃連降低43.29%，發病率提高59.92個百分點。分析原因，一方面，連作降低了黃連根際土壤的微生物數量，導致土壤酶活性降低、有機質分解速度減緩，土壤養分含量降低，從而導致作物減產，這與王鵬等[12]的分析結果類似；另一方面，連作破壞了黃連根際土壤的微生態環境，促使土壤由細菌型向真菌型轉化，病原菌數量增多、有益菌數量減少，從而導致病害加重，與洪潔等[13]的結論相似。本研究結果表明，伴生栽培對黃連連作障礙具有一定的緩解效果，小麥、大蔥及黑麥草3種作物伴生栽培中，以大蔥伴生栽培緩解效果最佳，產量較連作3 a的黃連提高67.63%，發病率降低47.32個百分點，與趙曉翠[15]、楊瑞娟等[16]、韋持章等[18]結論一致，這一方面是因為伴生栽培提高了黃連根際土壤的細菌、放線菌含量，從而緩解了因土壤酶活性降低而導致的土壤養分含量不足；另一方面，伴生栽培降低了根際土壤真菌含量，促使連作土壤由真菌型向細菌型轉化，改善了土壤微生態環境，從而降低了發病率。

土壤微生物是反映土壤生態系統的重要參數，參與土壤養分循環、有機質分解等重要的物質轉化和能量交換過程，其功能多樣性與土壤微生態環境穩定性密切相關[19]。根際土壤微生物多樣性和群落結構受植物根系分泌物調控，由于植物根系自毒物質的積累而導致的微生物群落結構失衡是造成連作障礙發生的主要因素[8-10]。植物間作、套作等栽培制度不僅可以增加地上部的物種多樣性，而且可以通過根系分泌物對土壤微生態環境起到調控作用[14，20]。本研究發現，連作導致黃連根際土壤細菌和真菌的Chao1指數、Ace指數及Shannon指數顯著降低，Simpson指數分別顯著升高30.77%和83.33%(P<0.05)；伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤細菌和真菌的多樣性與豐富度，小麥、大蔥及黑麥草3種作物伴生栽培中以大蔥伴生效果最好，根際土壤細菌Chao1指數、Ace指數、Shannon指數分別較連作3 a土壤提高11.03%、10.76%、21.53%，Simpson指數降低17.65%，真菌Chao1指數、Ace指數、Shannon指數分別提高54.08%、52.81%、36.41%，Simpson指數降低15.15%，與胡國彬等[14]、徐偉慧[17]的研究結果較為一致。根系分泌物作為土壤微生物的主要能源和碳源，對土壤微生物具有一定的選擇和塑造作用，其種類和數量決定了微生物的數量與群落結構，植物連作導致根系分泌物種類過少、數量過多是造成土壤微生物多樣性和豐富度降低的主要原因，而伴生栽培豐富了土壤中根系分泌物的種類和數量，增加了可利用的能源和碳源種類，從而提高了土壤微生物的多樣性和豐富度。

不同的栽培制度和農藝措施對土壤微生物群落結構具有明顯的影響[12-14,18-19]。生菜根際土壤變形菌門、厚壁菌門和放線菌門相對豐度在連作模式下逐漸降低，但是在生菜-菠菜輪作模式中則較為穩定，壤霉菌屬、黃桿菌屬及微細菌屬等有益菌屬成為輪作模式的優勢菌屬[13]。有機物料可顯著提高設施番茄長期連作土壤中變形菌門和放線菌門的相對豐度，顯著降低酸桿菌門的相對豐度，鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬及鏈霉菌屬等有益菌屬相對豐度升高，Gp4、Gp6等不利菌屬相對豐度降低[21]。本研究發現，連作改變了黃連根際土壤細菌和真菌優勢菌門的相對豐度，酸桿菌門、放線菌門、子囊菌門、擔子菌門等相對豐度顯著降低，而厚壁菌門、浮霉菌門、接合菌門和纖毛亞門等相對豐度顯著提高；在屬水平，連作顯著降低了紅游動菌屬、韋榮球菌屬、支頂孢屬及綠僵菌屬等優勢菌屬的相對豐度，而檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、假霉樣真菌屬及鐮刀菌屬等相對豐度則顯著升高。這主要是由于黃連根系分泌物不斷積累而導致微生物區系發生了重塑。伴生栽培豐富了黃連根際土壤中分泌物的種類與數量，進而顯著緩解了連作導致的細菌、真菌在門和屬水平的相對豐度變化，其中以大蔥伴生效果最佳。

土壤微生物菌群豐度與黃連發病率的相關性分析結果表明，假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬及檸檬酸桿菌屬等相對豐度與黃連發病率呈正相關，其作用機制可能是：一方面，該類菌群中可能有部分菌群本身就是黃連病害的病原菌；另一方面，該類菌群可能通過分解有機物、自身代謝等途徑產生促使病原菌侵染植物的物質，導致發病率提高。紅游動菌屬、韋榮球菌屬及支頂孢屬等相對豐度與黃連發病率呈負相關，其抗病機制可能涉及自身代謝產生抑制病原菌生長繁殖的分泌物、爭奪病原菌養分、誘導植物產生抗病性等多個途徑。因此，今后應對此類菌群進行深入研究，以期獲得對黃連病害具有生防作用的微生物菌劑。