玉米脫落酸受體ZmPYL9基因的克隆及功能探究

王延召，魯曉民，魏良明，周 波，黃 保

(河南省農業科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

植物通過復雜的調控網絡來應對干旱脅迫，如氣孔關閉、誘導干旱響應基因應答等。其中，脫落酸(ABA)作為重要的植物激素之一，參與植物多種生理過程，且對植物適應多種非生物脅迫具有重要的調控作用[1]。干旱脅迫刺激ABA的生物合成[2-3]，但是一直以來對ABA受體的研究較緩慢。RAZEM等[4]通過放射性同位素方法驗證了ABA與FCA蛋白的結合，但RISK等[5]研究證實FCA蛋白并不結合ABA。LIU等[6]研究表明，G蛋白偶聯受體與ABA結合[7]，但RISK等[5]質疑這一結論。PANDEY等[8]提出，GTGs膜蛋白可以結合ABA，但仍需要大量的代表性試驗來證實。直到2009年，PYR1基因被鑒定出來，同時證明PYL蛋白與ABA結合，引起構型變化，從而抑制下游PP2C蛋白的磷酸化活性，進而調節植物的生長發育[9]；之后MA等[10]利用酵母雜交也篩選到可與HAB1(Protein phosphatase 2C16)結合的PYL5、PYL6、PYL8蛋白。

PYL蛋白被證實是ABA的直接受體后，在擬南芥中鑒定出PYL蛋白家族有14個成員，被分為3個亞家族[11]，隨后，在水稻[12]、草莓[13]、黃瓜[14]、玉米[15]中分別鑒定出12、9、11、13個PYL蛋白，參考擬南芥PYL蛋白家族成員分類將其分為3個亞家族。但不同PYL蛋白的存在形式不同，PYL4、PYL5、PYL6、PYL8、PYL9、PYL10等以單體形式存在，而PYL1、PYL2等以二聚體形式存在。在功能方面，擬南芥中已有報道，除AtPYL13外，其他基因均可激活植物體內ABA下游相關基因的表達[16]；此外，水稻上亦有報道，OsPYL能夠正向調控ABA信號，提高水稻抗旱和抗鹽堿能力[17-18]。

玉米作為重要的糧食作物，經常受到干旱的影響，產量和糧食安全受到嚴重威脅。ABA在植物抵御逆境脅迫中具有重要功能，但目前對ABA受體PYL蛋白的功能報道多集中在擬南芥和水稻上，玉米上關于ABA和干旱脅迫誘導對PYL蛋白的影響報道甚少。鑒于此，以玉米為材料，克隆了一個PYL家族基因(Zm00001d010445)，暫時命名為ZmPYL9，分析ZmPYL9編碼蛋白質的進化關系、表達模式及其對干旱脅迫和ABA誘導的響應情況，并了解該基因的啟動子順式作用元件，預測該基因特異結合目標靶基因的DNA片段等，旨在為PYL蛋白家族基因在玉米逆境脅迫和ABA傳導中的作用研究提供參考，為抗逆性強的種質資源篩選提供依據，最終為挖掘抗旱優質資源、培育抗旱型玉米品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗材料為河南省農業科學院糧食作物研究所提供的抗旱性強的玉米自選系鄭H71。取大田正常生長的鄭H71抽雄期的根、莖、芽、葉、雄穗、雌穗、花粉、胚、胚乳，作為測定ZmPYL9基因時空表達的樣品。將鄭H71籽粒播種于營養土，生長至一葉一心時將幼苗從營養土中轉移至Hoagland營養液(pH值5.8)中，置于30 ℃光照培養16 h、26 ℃暗培養8 h，相對濕度為40%～55%的溫室中進行水培。當鄭H71長至三葉一心時，挑選長勢一致的玉米苗分別轉移至以下營養液中進行處理：Hoagland營養液(CK)、Hoagland營養液+20% PEG、Hoagland營養液+100 μmol/L ABA、Hoagland營養液+20% PEG+100 μmol/L ABA，分別在處理6、12 h時取各處理幼苗葉片，然后將各處理幼苗轉移至新鮮的Hoagland營養液中，恢復48 h后再次取各處理幼苗葉片。以上所有大田和室內樣品5株相同部位葉片混合為1個樣品，每個樣品3個生物學重復，且取樣后迅速將其放入液氮，存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA合成

利用EasyPure RNA Purification Kit提取鄭H71每個樣品的總RNA，然后根據TansScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis試劑盒說明書所提供的程序進行反轉錄，合成cDNA。

1.3 ZmPYL9基因cDNA的克隆

用BLAST在線工具搜索ZmPYL9基因序列，設計特異擴增引物(ZmPYL9-F:5′-ATGGTGGGTCTCGTCGGC-3′和ZmPYL9-R:5′-TCACTGATCGATCAGCGACG-3′)，以反轉錄的cDNA為模板進行擴增，然后將擴增產物連接pMD19-T并轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑選陽性單克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序，并利用NCBI數據庫比對測序結果。

1.4 ZmPYL9基因的生物信息學分析

使用在線工具MG2C繪畫玉米數據庫中的PYL基因在染色體上的分布；利用在線EXPASY中的Protparam對ZmPYL9基因所編碼蛋白質的等電點(pI)、分子質量(MW)、穩定性、疏水性等屬性進行計算；分別利用TMHMM Server和SOPMA網站對ZmPYL9蛋白的跨膜結構和二級結構進行分析，使用ExPASy網站的NetPhoS預測ZmPYL9蛋白的磷酸化位點；采用Plantcare預測ZmPYL9基因啟動子的順式作用元件；利用MEGA軟件中的NJ法構建ZmPYL9蛋白與其他物種同源蛋白質的系統發育樹；使用MEME在線分析ZmPYL9蛋白的保守基序(Motif)，基序的最大數目設置為8。

1.5 ZmPYL9基因的表達分析

采用qRT-PCR定量分析不同部位和不同處理玉米樣品ZmPYL9基因的表達，設計基因序列特異熒光引物(ZmPYL9-QF:5′-TCGTCAAGCACATCAAGG-3′和ZmPYL9-QR:5′-AGGCCGGTCTTGACGTTGA-3′)；以玉米18S為內參,設計引物18S1:5′-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3′,18S2:5′-GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG-3′。利用CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)，參考SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)試劑盒程序，采用兩步法進行Real-time PCR。根據2-△△CT(△CT=CT目標基因-CT內參基因，△△CT=△CT處理后-△CT對照)法進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 PYL基因家族在玉米染色體上的分布

圖1顯示了PYL家族基因在玉米10條染色體上的定位。從圖1發現，除了第7和第10染色體外，PYL家族基因隨機分布在8條染色體上，沒有特殊的染色體偏好。

圖1 ZmPYL基因家族在玉米染色體上的分布

2.2 ZmPYL9基因的克隆和蛋白質結構分析

利用RT-PCR技術擴增ZmPYL9基因，得到大小為600 bp左右的特異條帶(圖2)，回收并測序。分析測序結果發現，該序列包含一個完整的594 bp開放閱讀框，編碼197個氨基酸，與全基因組序列已經公布的玉米自交系B73的序列一致。

蛋白質結構分析發現，ZmPYL9分子質量為21.79 ku，理論等電點為 5.69，GRAVY值為-0.249，屬于親水性蛋白質；跨膜螺旋區分析結果顯示，ZmPYL9蛋白無跨膜結構域；SOPMA預測顯示，ZmPYL9蛋白無規則卷曲(L)占35.53%，β折疊(E)占3.55%，α螺旋(H)占43.65%，該蛋白質結構以α螺旋為主；NetPhoS分析顯示，ZmPYL9蛋白含有8個絲氨酸磷酸化位點、8個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點，說明ZmPYL9蛋白可能主要受絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶激活，從而調控下游靶基因的表達，參與植物的生長發育、信號傳導及逆境脅迫響應過程。

2.3 ZmPYL9蛋白的進化及保守基序分析

為了揭示玉米ZmPYL9基因的進化關系，利用NJ法構建ZmPYL9蛋白序列與其他單子葉和雙子葉植物同源蛋白質的進化樹(圖3)，分析發現，ZmPYL9蛋白與單子葉植物高粱同源蛋白質的進化關系最為緊密，與雙子葉植物大豆和胡桃木的進化關系較遠。為了進一步分析ZmPYL9蛋白及其他物種同源蛋白質的保守性，利用MEME軟件共鑒定了8個保守基序。由圖3可知，玉米與高粱不僅同源性較高，且在相同的氨基酸位置含有相同的6個保守基序；與大豆和胡桃木的進化較遠，其含有的保守基序相差較大。說明進化關系密切的物種保守功能基序也較為一致。

M為Trans5K DNA Marker，泳道1為ZmPYL9基因PCR擴增產物

8種顏色代表8個不同的保守基序；Zm00001d010445代表玉米；Sb09g006700代表高粱；Bradi2g32250代表二穗短柄草；AT5G53160代表擬南芥；LOC Os05g12260代表水稻；Pavir.Ca00496代表柳枝稷；Seita.3G076200代表谷子；Pahal.C00916代表胡桃木；Glyma07g06270代表大豆Eight colors represent eight different conservative motifs；Zm00001d010445 stands for Zea mays L.;Sb09g006700 stands for Sorghum bicolor (Linn.) Moench;Bradi2g32250 stands for Brachypodium distachyum (L.) Beauv.;AT5G53160 stands for Arabidopsis;LOC Os05g12260 stands for Oryza latifolia Desv.;Pavir.Ca00496 stands for Panicum virgatum Linn.;Seita.3G076200 stands for Setaria italica (L.) Beauv.;Pahal.C00916 stands for walnut;Glyma07g06270 stands for Glycine max (Linn.) Merr.圖3 ZmPYL9蛋白與其他物種同源蛋白的進化樹及保守基序

2.4 ZmPYL9基因啟動子順式元件分析

為了進一步解析ZmPYL9的潛在功能，分析ZmPYL9基因ATG上游2 000 bp的順式響應元件(表1)，發現該基因含有多種功能元件，除了啟動子本身核心元件TATA-box、CAAT-box外，還包含如ARE、AuxRR-core、CGTCA-motif、DRE core、ERE、GC-motif、STRE、TCA-element等結合位點。其中，ARE和GC-motif是厭氧誘導必不可少的響應元件；AuxRR-core屬于生長素響應因子，在胚乳、子葉和側根發育中起重要作用；CGTCA-motif和TCA-element參與茉莉酸和水楊酸信號途徑；DRE core、ERE和STRE響應多種非生物脅迫。另外，還發現大量光刺激應答元件(AT1-motif、GA-motif、Sp1)。推測ZmPYL9不僅響應逆境脅迫和激素信號傳導途徑，可能還參與植物光合作用和調控植物開花等光反應。

表1 ZmPYL9基因啟動子順式元件分析Tab.1 The cis element analysis of ZmPYL9 gene promoter

2.5 ZmPYL9基因的組織表達模式分析

為了解ZmPYL9基因的表達模式，利用qRT-PCR分析該基因在不同組織中的表達情況(圖4)，結果顯示，ZmPYL9基因在根、莖、葉、雌穗、雄穗、花粉、胚、胚乳中均有表達，但在胚乳中表達量最高，其次是雄穗和根?？梢?，ZmPYL9基因屬于組成型表達基因，但在不同部位的表達量存在一定的差異。

R.根;S.莖;L.葉;T.雄穗;E.雌穗;P.花粉;Eb.胚;Ed.胚乳

2.6 ZmPYL9基因對PEG脅迫和ABA誘導的響應模式

由圖5可見，ABA誘導6、12 h時，ZmPYL9表達量均高于CK，但恢復48 h后ZmPYL9相對表達量低于CK；PEG和PEG+ABA脅迫6、12 h時，ZmPYL9表達量均低于CK，但恢復48 h后ZmPYL9表達量上升且PEG脅迫處理的ZmPYL9表達量遠高于CK；同時發現，ABA+PEG脅迫較PEG脅迫提高了該基因的表達量，也就是說外源ABA可以提高干旱脅迫下ZmPYL9基因的表達量。說明ZmPYL9基因響應干旱脅迫和ABA誘導，且受ABA的正向誘導，受PEG和PEG+ABA脅迫的負向誘導。

圖5 ZmPYL9基因響應干旱脅迫和ABA誘導模式

3 結論與討論

玉米是重要的糧食、飼料、加工原料等，其需求量越來越大。近年來，干旱導致的玉米產量下降已成為急需解決的嚴峻問題。篩選抗旱玉米種質資源并挖掘其自身的抗旱優質分子資源是一條有效的解決手段。植物可通過ABA信號途徑應對干旱脅迫，如關閉氣孔、誘導干旱基因應答等方式。PYL基因作為ABA受體，直接影響ABA的生物合成。目前，關于玉米PYL家族基因的抗旱功能研究報道甚少，基于此，本研究克隆了一個ZmPYL9基因，編碼197個氨基酸，蛋白質結構主要以α螺旋為主，且該蛋白質可能主要被絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶激活，從而調控下游靶基因的表達，參與植物的生長發育和逆境脅迫響應過程。系統進化及保守基序分析發現，ZmPYL9蛋白與高粱不僅同源性較高，且基序一致，進化關系較為緊密；與大豆和胡桃木的進化關系較遠，含有的保守基序相差較大。說明物種間的進化關系與其保守功能基序較為一致。

本研究分析發現，ZmPYL9基因啟動子區域存在多個順式元件，說明ZmPYL9基因的表達可能受多種轉錄因子的調控，且這些轉錄因子與多種信號途徑相關。這些順式元件包含生長素、茉莉酸、水楊酸等多種激素的應答元件，說明ZmPYL9基因的表達除響應ABA外，還受其他激素的調節，參與多種激素信號轉導網絡。但前人研究表明，與激素應答相關的順式元件存在冗余的可能，這一結論在水稻和擬南芥上均有驗證[19]。

本研究發現，ZmPYL9基因在玉米多個組織中均存在表達，說明該基因屬于組成型表達基因。該結果與擬南芥AtPYL3、AtPYL10、AtPYL11、AtPYL12和AtPYL13的研究結論一致[20]，但與AtPYL8[21]不同。SAAVEDRA等[21]研究表明，AtPYL8基因表達具有時空特異性，只在根中表達，說明PYL家族基因在表達模式上有所區別。

ZmPYL9基因正向響應外源ABA誘導，而恢復正常培養后，該基因表達量急速下降且低于CK，說明ZmPYL9基因確實參與ABA信號途徑；ZmPYL9基因被PEG和PEG+ABA負向誘導，且PEG+ABA脅迫下表達量高于PEG脅迫，而恢復正常培養后，2種脅迫下ZmPYL9表達量均表現上升趨勢，說明ZmPYL9基因響應干旱脅迫，且ABA可以提高干旱脅迫下該基因的表達量。前人對PYL家族基因的功能研究發現，OsPYL5過表達的轉基因水稻產量降低[18]；AtPYL4基因過表達導致擬南芥幼苗的蓮座葉變小[22]；AtPYL5、AtPYL8和AtPYL9的過量表達不僅能夠顯著提高植物在種子萌發、幼苗生長等階段對ABA的敏感性，而且還能提高植物的抗旱能力[21,23]。這些結果表明，轉PYL基因雖提高了植物的抗旱性，但也會帶來一些不良影響，因此在轉基因的過程中要盡可能地不影響植物的其他優良性狀。