外源脯氨酸對Cd脅迫下107楊光合與葉綠素熒光特性的影響

趙串串, 侯文濤, 溫懷峰, 汲紹文, 王 雪, 余登舉

陜西科技大學環境科學與工程學院, 陜西 西安 710021

近年來，植物修復技術為解決土壤Cd污染提供了一條全新治理途徑而備受人們關注[1]. 研究發現，木本植物中速生的楊柳科具有生物量大、根系發達、對Cd耐性好、經濟可行、抑制Cd污染向食物鏈中轉移等優勢，故將其應用于Cd污染土壤的修復具有良好的前景[2-3]. 當前，利用楊樹修復Cd污染的研究主要集中于低濃度Cd脅迫對楊樹光合作用[4]及葉綠素熒光參數[5]、葉片滲透調節物質[6]、干物質分配的影響[7]，而關于外源添加物下楊樹對高濃度Cd脅迫的光合生理響應研究較少[8].

脯氨酸是植物體內水溶性最大的氨基酸，也是干旱、高溫、高鹽、冰凍、紫外光照射和重金屬等逆境脅迫下植物體內積累的主要滲透調節物質[9-10]，外源脯氨酸可以提高逆境脅迫下植物的抗氧化能力，促進植物生長，從而提高植物耐受能力[11-12]. 目前，關于外源脯氨酸緩解Cd對植物的脅迫研究主要集中在較低濃度Cd對小麥[13]、白菜[14]和稻谷[15]等農作物生理影響的研究，而高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對楊樹光合生理指標的影響還有待進一步揭示，因此該文以107楊苗木為試驗材料，基于葉綠素熒光技術，探討高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對107楊葉片光合氣體交換參數、葉綠素熒光特性的影響，以期從光合生理角度闡明外源脯氨酸對107楊抗Cd脅迫的調節機制，進一步提高107楊的耐Cd能力，將其應用于礦區高濃度Cd污染土壤修復具有重要的現實意義.

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料107楊(Populus×euramericanacv. ‘7476’)采自陜西省楊凌示范區，2018年3月上旬將地徑約1 cm的一年生107楊苗木截成長20 cm的枝條，在自然光放置于Hoagland營養液[16]中水培，每2 d換一次營養液，15 d后選擇長勢一致的苗木移栽到內徑30 cm、深40 cm的塑料盆中，1株盆，生長基質采用田園土(每盆6 kg). 苗木移栽后，每天對所有供試植株統一澆蒸餾水，消除水分脅迫的影響，每周添加100～200 mL Hoagland營養液保證養分供給，1個月后選擇生長勢均勻的107楊實生苗進行外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理.

1.2 試驗處理

根據前期試驗研究和相關文獻[17]報道，土壤中w(Cd)為100 mgkg左右時會對107楊光合作用產生明顯脅迫. 為此該試驗設計2個試驗因素，即外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理，其中，外源脯氨酸處理設3個水平——0、10和20 mmolL，Cd脅迫處理設4個水平——0、100、200和300 mgkg. 試驗共設12個處理，分別記為0Cd+0Pro(對照)、0Cd+10Pro、0Cd+20Pro、100Cd+0Pro、100Cd+10Pro、100Cd+20Pro、200Cd+0Pro、200Cd+10Pro、200Cd+20Pro、300Cd+0Pro、300Cd+10Pro和300Cd+20Pro，每個處理均設5次重復，共計60盆. Cd脅迫處理是以分析純CdCl2·2.5H2O 配置成相應濃度的Cd溶液施入盆栽土壤中，外源脯氨酸處理是以每天傍晚在107楊苗木葉面噴施等量的去離子水或不同濃度的脯氨酸進行，處理期間每隔1 d更換處理液，以葉面剛好完全打濕為標準，每天對所有供試植株進行統一管理，采用質量差減法使各處理保持相同的土壤含水量. 2018年6月中旬測定苗木葉片光合氣體交換參數和葉綠素熒光參數.

1.3 測定指標和方法

1.3.1氣體交換參數的測定

2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:00—11:00進行光合參數測定. 使用LI-6400便攜式光合儀(LI-Cor Inc.，USA)測定107楊葉片在光強1 200 μmol(m2·s)下的葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等參數. 107楊苗葉片木水分利用效率(WUE)的計算公式為WUE=PnTr[18]. 測定過程中的環境狀況：氣溫為(22.45±2.31)℃，相對濕度為57.13%±2.45%，空氣中CO2濃度為(379.51±13.25)μmolmol. 各處理均測定5次，結果取其平均值.

1.3.2光合光響應曲線的測定

2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:30—11:00選取107楊苗木中長勢一致的成熟葉片作為測定對象，采用Li-6400便攜式光合測定儀配置紅藍光源(LI-Cor Inc.，USA)測定葉片光合作用對光合有效輻射(PAR)的響應曲線，測定過程中，氣體流速控制為500 μmol(m2·s)，使用CO2鋼瓶控制葉室CO2濃度為380 μmolmol，由溫度控制器控制葉室溫度為25 ℃，6400-02B LED紅藍光源提供不同PAR，PAR梯度設定為 2 000、1 800、1 500、1 200、900、700、500、300、200、100、75、50、25和0 μmol(m2·s). 在測定前，葉片先用 1 200 μmol(m2·s)的光強適應30 min，待儀器讀數穩定后進入自動測量程序，測定結束后繪制凈光合速率的光響應曲線(Pn-PAR)，并依據直角雙曲線修正模型[19]，計算方法如式(1)所示. 通過SPSS 19.0 統計軟件對107楊光響應曲線測量值進行非線性回歸擬合，得到暗呼吸速率〔Rd，μmol(m2·s)〕、光補償點〔LCP，μmol(m2·s)〕、最大凈光合速率〔Pnmax，μmol(m2·s)〕和光合量子效率(AQY，molmol)等光合生理參數.

(1)

式中：Pn為凈光合速率，μmol(m2·s)；PAR為光合有效輻射，μmol(m2·s)；α為光響應曲線的初始斜率；β為修正系數；γ為光飽和項；Rd為植物暗呼吸速率，μmol(m2·s).

1.3.3葉綠素熒光參數測定

采用Li-6400便攜式光合測定儀配置熒光葉室6400-40于08:30—11:30對107楊葉片葉綠素熒光參數進行測定，選取與光合-光響應曲線測量相同的葉片，經過30 min暗適應后，照射檢測光測定最小熒光(Fo)，然后施加飽和脈沖為 7 200 μmol(m2·s)的光強照射0.8 s，測得暗適應下的最大熒光(Fm)，熒光參數的計算參照Rohacek[20]的方法，PSⅡ中原初反應最大量子效率(FvFm)的計算公式為FvFm=(Fm-Fo)Fm. 用葉室內活化光將植株充分活化1 h，待儀器讀數穩定后在 1 200 μmol(m2·s) 的光強下測定光適應下植株葉片的最大熒光(Fm′)、最小熒光(Fo′)和穩態熒光(Fs). 基于以上參數計算表觀光合電子傳遞速率(ETR)、實際光化學量子效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qP)及非光化學淬滅系數(NPQ)等熒光參數.

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，數據經方差分析后進行多重比較(Tukey′s法，α=0.05)，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)來揭示Cd脅迫處理與外源脯氨酸處理及二者交互作用對107楊葉片光合與葉綠素熒光等指標的影響；采用Origin 8.6軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊氣體交換參數的影響

表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數的影響

Table 1 Effect of exogenous proline on photosynthetic gas exchange parameters in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’ under different Cd addition levels

表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數的影響

項目w(Cd) ∕(mg∕kg)c(脯氨酸)∕(mmol∕L)Pn∕[μmol∕(m2·s)]Gs∕[mol∕(m2·s)]Tr∕[mmol∕(m2·s)]Ci∕(μmol∕mol)WUE∕(μmol∕mmol)試驗處理顯著性分析021.42±1.15a0.37±0.02a5.35±0.36a240.87±28.04a4.00±0.28a01021.64±1.01a0.36±0.02a5.32±0.23a242.36±20.03a4.07±0.30a2021.17±0.59a0.35±0.02a5.17±0.36a250.01±26.02a4.29±0.35a014.09±0.80b0.24±0.02b3.97±0.25b308.19±27.03b3.24±0.35b1001021.43±0.70a0.34±0.02a5.42±0.26a248.34±26.04a3.95±0.36a2020.61±1.03a0.30±0.03ab5.29±0.40a253.30±26.04a3.89±0.24ab07.91±1.04c0.14±0.02c2.30±0.35c358.12±20.02c2.70±0.25c2001017.66±0.96e0.26±0.03b4.04±0.31b310.26±25.03b3.88±0.30ab2016.30±1.20be0.30±0.03ab3.97±0.32b319.30±20.03b3.28±0.32b04.56±0.99d0.10±0.01d1.56±0.30c368.10±22.01c1.80±0.21d300107.54±0.86c0.13±0.02c1.83±0.29c362.13±20.02c2.13±0.22cd208.12±0.98c0.12±0.02cd2.00±0.19c300.12±21.02b2.01±0.30dc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*******c(脯氨酸)×w(Cd)*********

注： 數據為平均值±標準差，n=15. 每列數據右側字母相同者表示差異未達顯著水平(P>0.05)； 字母不同者表示差異達顯著水平(P<0.05)．雙因素方差分析結果： NS表示無顯著差異； *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.

2.2 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊光響應特征參數的影響

由圖1可見，隨著光強的增加，不同處理條件下107楊葉片Pn表現出先逐漸上升后趨于平緩的趨勢. 在PAR<200 μmol(m2·s) 水平下，Pn隨著光強的增強而迅速增加，當PAR>800 μmol(m2·s) 時Pn逐漸達到光飽和點. 與對照組相比，單獨外源脯氨酸處理對107楊葉片光響應曲線幾乎沒有影響，Cd脅迫處理顯著影響107楊葉片Pn的變化，使其Pn值低于對照組；與單獨Cd脅迫處理對比，外源脯氨酸處理顯著增加了Pn值. 在w(Cd)>200 mgkg條件下，PAR>1 800 μmol(m2·s) 時，光響應曲線下降明顯，產生光抑制現象. 107楊葉片Rd、Pnmax和AQY均隨著脅迫強度的增加逐漸下降，在w(Cd)<200 mgkg、單獨脯氨酸處理下，各處理組107楊葉片的光響應參數均無顯著差異(P<0.05).

由圖2可見，與單獨Cd脅迫處理組相比，外源脯氨酸處理顯著提高了植株Pnmax、Rd和AQY，降低了LCP，提高了光能利用效率. 雙因素方差分析(見表2)表明，Cd脅迫作為獨立因子顯著影響了107楊葉片的光響應參數(P<0.05)，而外源脯氨酸作為獨立因子對光響應參數無顯著影響，與單獨Cd脅迫處理組相比，交互處理顯著影響了植株的光響應參數(P<0.01).

圖1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片光響應曲線的影響Fig.1 Effect of exogenous proline on light response curves in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’under Cd stress

2.3 不同濃度脯氨酸對Cd脅迫下107楊葉綠素熒光參數的影響

由圖3可見，隨著w(Cd)的增加，107楊葉片的FvFm、ΦPSⅡ、qP和ETR均呈下降趨勢，且各處理之間差異顯著(P<0.05)；NPQ明顯升高，與單獨Cd脅迫處理組差異顯著(P<0.05). 雙因素方差分析(見表3)表明，Cd作為獨立因子時會顯著影響FvFm、ΦPSⅡ、qP、ETR和NPQ，外源脯氨酸作為單獨因子時對107楊葉片葉綠素熒光參數無顯著影響. 與單獨Cd脅迫處理相比，交互條件下外源脯氨酸處理的植株具有更高的qP、ΦPSⅡ以及更低的NPQ.

c(脯氨酸)(mmolL): 1—0； 2—10； 3—20.

圖3 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片葉綠素熒光參數的影響Fig.3 Effect of exogenous proline on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’ under Cd stress

表2 脯氨酸、Cd及其交互效應對107楊葉片光響應參數影響的顯著性檢驗

Table 2 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on light response parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’

表2 脯氨酸、Cd及其交互效應對107楊葉片光響應參數影響的顯著性檢驗

因子RdPnmaxLCPAQYc(脯氨酸)NSNSNSNSw(Cd)****c(脯氨酸)×w(Cd)********

注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.

3 討論

在逆境脅迫下，當植物本身產生的脯氨酸不足以消除逆境傷害時，可以使用外源脯氨酸來緩解逆境傷害[21]，外源脯氨酸在增強作物對干旱、鹽、高溫和重金屬等逆境脅迫耐性方面具有重要的作用[22]. 該研究結果表明，107楊葉片的Pn、Gs隨著w(Cd)的增大而降低，同時伴隨著Ci的升高，說明Cd脅迫下107楊葉片光合作用的降低是由于非氣孔因素導致的. 這與馮世靜等[23]對灰楊(Populus×canescens)和青楊(Populuspseudo-simonii)在Cd脅迫條件下的響應特征相似. Cd脅迫下，107楊葉片光合電子傳遞反應受阻，用于碳固定Rubisco羧化酶活性受到抑制，阻礙了CO2的利用，從而造成胞間CO2積累，這與高會玲等[24]對Cd脅迫下菊芋光合作用和徐小遜等[25]對Cd脅迫下豨薟光合作影響的研究結論一致，同時Cd會引起光合作用暗反應中ATP和NADPH利用率的下降[26]，進而降低107楊的碳固定效率. Zouari等[27]研究發現，在土壤中施加不同濃度Cd可不同程度地降低椰棗樹(PhoenixdactyliferaL.)的Pn、Gs、Tr、WUE，而外源添加20 mmolL的脯氨酸可明顯緩解Cd脅迫對光合作用的抑制作用，且不同處理之間的緩解程度有所不同. 該研究結果表明，Cd脅迫下，添加外源c(脯氨酸)為10和20 mmolL后，Pn、Tr和Gs與單獨Cd處理組相比均得到顯著提高、Ci均降低，這與楊曉春等[28]在Cd脅迫下外源6-BA對茄子苗木生長光合特性的研究結果一致，說明外源脯氨酸可通過緩解對107楊非氣孔的限制，從而促進PSⅡ在Cd脅迫下對CO2的吸收和利用，增加植物光能捕獲，提高光化學效率[29]，緩解Cd對光合作用的抑制作用.

表3 Cd、脯氨酸及其交互效應對107楊葉片葉綠素熒光參數影響的顯著性檢驗

Table 3 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on chlorophyII fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’

表3 Cd、脯氨酸及其交互效應對107楊葉片葉綠素熒光參數影響的顯著性檢驗

因子Fv∕FmΦPSⅡqPNPQ ETRc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*****c(脯氨酸)×w(Cd)*******

注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.

光合光響應模型所獲得的光合生理參數是甄別植物光合機構運轉狀況、不同生境的光合能力及適應規律的有效依據[30]. 該研究中，107楊葉片Pnmax、AQY和Rd均隨著Cd脅迫的加重而顯著降低，LCP顯著升高，表明Cd脅迫降低了107楊葉片在強光和弱光下的光合效率和光能利用能力，107楊通過減少呼吸作用的消耗來維持自身代謝平衡，對光強具有一定的適應性，同時也可能是Cd脅迫限制了其生理活性，減少了對于能量的需求，這與鄭明瑜等[31]對Cd脅迫下煙草光合作用的研究結果一致. 在w(Cd)分別為100和200 mgkg條件下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時會使107楊葉片Pnmax分別提高46.61%和60.11%，說明外源脯氨酸處理可顯著緩解Cd脅迫對107楊葉片Pnmax的抑制作用. 此外，不同濃度Cd脅迫下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時均會不同程度地提高107楊葉片的AQY和Rd，降低LCP，說明外源脯氨酸處理可顯著提高Cd脅迫下107楊葉片光合效率和利用弱光的能力.

在活體狀態下，植物的葉綠素熒光全部由PSⅡ反應中心產生[32]. PSⅡ原初反應的FvFm和ΦPSⅡ是判斷植物是否受到光抑制的重要指標，是研究植物對逆境脅迫響應的理想參數[33-34]. 正常條件下，植物通常表現出較高的FvFm和ΦPSⅡ值，可以使植物獲得較高的光能轉化效率，從而有利于能量的同化積累[35]. 該研究中，w(Cd)為200 mgkg時，與對照組相比，107楊葉片FvFm和ΦPSⅡ分別下降12.41%和37.88%，說明107楊葉片的原初光化學效率和從天線色素到PSⅡ反應中的傳能效率明顯受到Cd脅迫的影響，出現了光抑制現象. 同時，107楊葉片的qP和ETR也隨w(Cd)的升高而顯著降低，NPQ的變化規律則相反，這與甘龍等[36]對Cd脅迫下一年蓬(Erigeronannuus)葉綠素熒光特性的研究結果一致，說明Cd脅迫使107楊葉片的光合機構受到一定程度的傷害，PSⅡ反應中心氧化端電子傳遞受阻，光能轉化效率以及捕獲激發能的效率受到影響，用于熱耗散等非光化學反應的能量增加.w(Cd)為200 mgkg時，與單獨Cd脅迫處理組相比，外源添加c(脯氨酸)為10和20 mmolL下107楊ETR顯著提高了63.26%和50.92%，并以c(脯氨酸)為10 mmolL處理時的效果更佳，表明外源脯氨酸處理緩解了Cd對反應中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復，從而使植物能夠維持正常的暗反應等基本生理功能.

4 結論

a) Cd脅迫對107楊光合相關生理過程的影響較為復雜. 在w(Cd)低于200 mgkg時，添加外源脯氨酸可有效促進107楊的光合作用和提高水分利用效率，從而降低高濃度Cd脅迫對107楊光合作用的抑制，且以c(脯氨酸)為10 mmolL的效果較好；在w(Cd)為300 mgkg時，107楊的生長明顯受到抑制，外源脯氨酸處理雖能夠起到一定緩解作用，但作用較小.

b)w(Cd)低于200 mgkg時，添加外源脯氨酸能夠通過非氣孔限制來提高107楊葉片ΦPSⅡ、qP和ETR，緩解Cd對反應中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復，進而緩解Cd脅迫對107楊的傷害，在礦區高濃度Cd污染地區的生態恢復中具有一定的應用潛力.