脊髓活性氧激活自噬參與調節2型糖尿病神經病理性疼痛*

陳佳麗 張茂表 陸嘉輝 賈改麗 李 軍 曹 紅

（溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科；溫州醫科大學疼痛醫學研究所，溫州 325027）

糖尿病是一種常見的慢性疾病，全球有超過4.25億成人患病，約90%的糖尿病病人是2型糖尿病[1]，而糖尿病神經病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，大約1/3以上的糖尿病人會并發DNP，嚴重影響病人的正常生活，且現有藥物治療效果不佳[2]。臨床上主要表現為自發痛、感覺異常、痛覺過敏以及異常性疼痛[3]，然而其病理生理機制尚未闡明。近年研究表明，長期高血糖導致的神經受損異常放電、交感神經激活和氧化應激性代謝紊亂是DNP的主要發病機制[4]?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)是一系列具有高度活性的氧自由基的總稱，研究發現，包括神經病理性疼痛和炎性疼痛在內的持續性疼痛與ROS的過度表達有關[5]。自噬是一種溶酶體依賴性的自我消化過程，回收利用損傷或功能不足的蛋白質或細胞器，比如受損的線粒體[6]。在神經病理性疼痛模型中，脊髓神經元和膠質細胞中自噬活動都有明顯改變，自噬在慢性疼痛中起到重要作用[7]。而研究表明ROS作為信號分子參與自噬的調節[8]，但ROS與自噬在2型糖尿病神經病理性疼痛中的作用尚未見報道，本實驗我們擬觀察ROS對脊髓自噬的影響，探討脊髓ROS介導自噬與大鼠2型DNP的關系。本研究將首次闡明DNP中兩種重要致病因素ROS與自噬之間的關系，為臨床上治療DNP提供可行的新思路。

方 法

1.主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素 (streptozocin, STZ)，N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-Butyl-α-phenylnitrone, PBN)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)均購自Sigma；ROS檢測盒購自南京建成生物公司；Beclin 1抗體、LC3和p62抗體均購自Abcam；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；2390型Electronic von Frey觸覺測痛儀及II Tc336型甩尾足底測試儀購自IITC；電泳轉膜儀購自Bio-Rad；熒光顯微鏡購自Leica。

2.動物模型制備及分組

清潔級雄性SD大鼠，120～150 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。大鼠飼養于12 h/12 h晝夜交替，溫度23℃～25℃，自由攝食攝水的環境中。適應環境3 d后，將其隨機分為兩組：正常對照組（C組，n= 10）和高脂高糖喂養組（DA組，n= 80），正常對照組始終給予正常飼料喂養，高脂高糖組喂養高脂高糖飼料（67%普通飼料+ 10%豬油+ 20%蔗糖+ 2%膽固醇+ 1%膽酸鈉）喂養8周誘導胰島素抵抗，于第0周、第8周分別測體重、血糖，并在第8周時取大鼠尾靜脈血用ELISA法測血清胰島素水平，計算胰島素敏感性（ISI, 1÷空腹血糖×血清胰島素）。測量第8周時大鼠的機械縮足反應閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)，設為基礎值。高脂高糖喂養8周后，大鼠誘導出胰島素抵抗，禁食不禁飲12 h，腹腔單次注射STZ (35 mg/kg)。3 d后測量大鼠尾靜脈血糖，血糖穩定且≥16.7 mmol/L為2型糖尿病制備成功，14 d后測量大鼠痛閾值，MWT和TWL均下降至基礎值的85%以下為2型糖尿病神經病理性疼痛組，而MWT和TWL均高于85%基礎值的歸為2型糖尿病不痛組（PL組）。采用隨機數字表法，將2型DNP大鼠分為3組：DNP組，DNP + PBN組（DNP +ROS清除劑組），SC組（溶劑對照組），每組10只。PBN的給藥方式為腹腔注射，100 mg/kg，溶解于DMSO，在STZ注射14 d，模型制備成功后，每天1次，連續給藥14 d，DNP組不做任何處理，SC組給予同體積的DMSO。

3.方法

（1）ELISA—胰島素和胰島素敏感指數測量：在喂養8周后，禁食不禁飲12 h后，取正常對照組和高脂高糖組大鼠尾靜脈血，用ELISA測試盒檢測大鼠胰島素濃度，并通過計算公式（1÷空腹血糖×血清胰島素）計算得出胰島素敏感指數，此計算所得數值為非正態分布，故采用其自然對數進行統計分析。

（2）行為學測定：喂養8周后測量大鼠的機械縮足反應閾值和熱縮足反應，設為其基礎值，在STZ注射14 d后和給藥3、7、14 d后分別測量大鼠的機械縮足反應閾值和熱縮足反應。

機械縮足反應閾值的測定：將大鼠置于金屬絲網底籠(22 cm×22 cm×22 cm)中并適應30 min，玻璃箱被置于高于實驗臺面50 cm。用IITC 2390型Electronic von Frey觸覺測痛儀垂直刺激后爪的足底表面，單次刺激時間≤1 s，刺激間隔10 s。記錄大鼠抬起其后爪的刺激強度，測量5次，每次間隔5 min，并將平均值用作MWT。

熱縮足潛伏期的測定：將大鼠置于透明的方形有機玻璃盒（3 mm厚，20 cm×15 cm×30 cm）中并適應30 min。將后爪的中心暴露于由IITC 336型足底/甩尾測試儀設定的熱刺激。動物的反應時間從輻射熱測量開始直到大鼠縮足或舔足并記錄為TWL，雙足各測定5次，每次間隔5 min，并將平均值用作TWL。

（3）標本取材和處理：給藥后第3 d、7 d、14 d取各組大鼠L4-L6脊髓腰膨大，并放入超低溫冰箱中備用于Western blot實驗。另取5只大鼠麻醉后經心臟灌注先生理鹽水后4%多聚甲醛，取L4-L6脊髓腰膨大，固定脫水后用OCT包埋，切片，用作免疫熒光實驗。

（4）Western blot：將組織標本按重量體積比1:10加入裂解液，充分研磨，超聲離心后取上清液，后用BCA法測定蛋白濃度。按照30 μg、10 μl每孔上樣，經12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到0.45 μm PVDF膜上，10%脫脂牛奶常溫搖床2 h，以封閉非特異性蛋白位點，再分別加入Beclin 1抗 體 (1:2 000)、LC3抗體 (1:1 000)、p62抗體(1:20 000)和β-actin抗體(1:3 000)中，4℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST洗膜3次，每次10 min，加入堿性磷酸酶標記的IgG抗體，室溫下孵育2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光。條帶采用Quantity One進行分析，以目的蛋白/β-actin的灰度值作為目的蛋白表達的相對強度。

（5）免疫熒光染色使用冰凍切片機將已灌注包埋好的組織切成6 μm厚的切片，室溫下復溫30 min，PBS洗片3次，每次10 min，隨后在室溫下用含0.2%Triton X-100的PBS溶液滲透30 min，用免疫熒光封閉液（碧云天）37℃下封閉15 min，再分別加入Beclin 1抗體(1:200)、NeuN抗體(1:200)、IBA抗體(1:200)、GFAP抗體(1:200)，4℃過夜，次日用PBS洗片（如前），加入熒光標記二抗，37℃孵育1 h后PBS洗片（同前），DAPI染核，封片，熒光顯微鏡觀看組織形態。

（6）ROS含量檢測：根據ROS檢測試劑盒說明操作，測量脊髓腰膨大中的ROS含量。熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)用于檢測ROS，其自身非熒光，在ROS的存在下被氧化成發熒光的DCF。取100 mg脊髓腰膨大組織，用機械法制備成單細胞懸液，用PBS洗滌2次，加入10 μM DCFH-DA 37℃孵育30 min，用PBS洗滌后，使用流式細胞儀檢測ROS含量，通過CytExpert分析軟件統計處理。

4.統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差(D)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P< 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.各組大鼠體重、血糖、胰島素敏感指數的變化情況

與正常對照組（C組）比較，高脂高糖組（DA組）大鼠的體重在第8周時明顯升高(P< 0.05)，注射STZ 14 d后體重下降明顯(P< 0.05)，而空腹血糖在第8周時無明顯變化，注射STZ 3 d后血糖明顯升高（P< 0.05，見表1）。第8周時，高脂高糖組（DA組）大鼠的胰島素水平較正常對照組（C組）明顯升高(P< 0.05)，胰島素敏感指數下降(P< 0.05)，產生胰島素抵抗（見表2）。

2.各組大鼠MWT和TWL的變化

與C組比較，PL組大鼠MWT和TWL均無明顯改變，兩組差異無統計學意義；而DNP組和SC組與C組比較，MWT明顯降低(P< 0.05)，TWL縮短(P< 0.05)；當腹腔內注射ROS清除劑PBN后，與DNP組比較，DNP + PBN組在給藥后第3 d、7 d、14 d MWT升高(P< 0.05)，TWL明顯延長(P< 0.05)。DNP組和SC組兩組之間MWT和TWL差異無統計學意義（見圖1）。在注射STZ 17 d、21 d、28 d后DNP組中ROS含量明顯升高(P< 0.05)，說明2型糖尿病神經病理性疼痛大鼠的ROS相關氧化應激活性增強 （見圖2）。

表1 C組和DA組體重、血糖的比較 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

表1 C組和DA組體重、血糖的比較 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，與C組比較，compared with group C.

體重Weight (g) 血糖Blood glucose (mmol/L)0 week 8 weeks 14 d after STZ 0 week 8 weeks 3 d after STZ C 138±7 365±10 434±18 3.5±0.4 3.6±0.5 4.4±0.7 DA 134±11 427±23* 320±26* 3.7±0.9 4.0±0.7 29.3±3.8*組別Group

表2 C組和DA組胰島素水平、胰島素敏感指數的比較 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

表2 C組和DA組胰島素水平、胰島素敏感指數的比較 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，與C組比較，compared with group C.

胰島素水平Insulin levels (mU/L) 胰島素敏感指數ISI 0 week 8 weeks 0 week 8 weeks C 16.5±1.4 16.9±2.3 -4.13±0.29 -4.38±0.21 DA 16.8±0.8 46.1±5.0* -4.19±0.18 -7.21±0.22*組別Group

圖1 各組大鼠MWT和TWL的變化 (n = 10,D)Fig.1 Changes of MWT and TWL in each group of rats (n = 10,D)

3.DNP中發生的自噬可被PBN抑制

DNP大鼠給予PBN后第3 d、7 d、14 d，Western blot檢測脊髓腰膨大中的蛋白表達量，與C組比較，PL組的脊髓中Beclin 1和p62表達無明顯改變，而LC3-II表達上調(P< 0.05)，說明自噬體合成增加；與PL組比較，DNP組和SC組的脊髓中LC3-II和Beclin 1表達均明顯上調(P< 0.05)，而p62表達量明顯下降(P< 0.05)，說明DNP組大鼠脊髓自噬功能激活；與DNP組比較，使用了ROS清除劑PBN后，脊髓中的LC3-II和Beclin 1表達均明顯下降(P< 0.05)，而p62表達量升高(P< 0.05)；DNP組和SC組間差異無統計學意義（見圖3）。免疫熒光染色顯示在脊髓背角中自噬的標記蛋白Beclin 1主要與小膠質細胞的標記蛋白(IBA)和星形膠質細胞的標記蛋白(GFAP)共定位，表明自噬可能主要發生在脊髓背角的小膠質細胞和星形膠質細胞中（見圖4）。

圖2 流式細胞儀檢測大鼠脊髓中ROS的含量 (n = 4,D)Fig.2 The production of ROS in spinal cord detected by flow cytometry (n = 4,D)

討 論

活性氧(ROS)作為一部分正常細胞代謝所產生的具有活性的含氧化合物，主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。中樞神經系統中ROS的主要來源是線粒體內膜中的電子傳遞鏈，在生理狀態下的低濃度ROS對于機體防御功能是必要的，但過量的ROS會導致脂質過氧化、蛋白質氧化、核酸氧化[9]。既往研究表明，ROS參與多種疾病的病理生理過程，包括哮喘、動脈粥樣硬化、阿爾茲海默病等，近期研究顯示ROS在各種疼痛疾病模型中起著關鍵性作用，包括炎性疼痛和神經病理性疼痛。使用ROS清除劑如PBN[10]、維生素E[11]、Tempol[12]等，可以有效緩解神經病理性疼痛模型大鼠的疼痛行為。本研究結果表明，與正常大鼠或糖尿病無痛大鼠比較，在造模成功后第3 d、7 d、14 d 糖尿病神經病理性疼痛大鼠脊髓中ROS含量明顯增加，使用ROS清除劑PBN后，糖尿病神經病理性疼痛大鼠的疼痛行為顯著緩解，提示脊髓中ROS含量增加參與了2型糖尿病神經病理性疼痛發生維持的機制。

自噬是真核細胞通過溶酶體系統降解自身成分的一種高度保守的分解代謝途徑，在多種應激狀態下，對于清除氧化或受損的細胞器或蛋白質以及維持新陳代謝和分子合成具有非常重要的作用[13]。文獻報道自噬激動劑雷帕霉素可以產生長時程的鎮痛和抗炎效果，且激活自噬可以促進神經再生和髓鞘形成，防止慢性疼痛的形成，而自噬阻滯劑3-MA會使神經病理性疼痛得到明顯的加重和延長[7]。研究證明，活性氧的產生、低氧刺激、病毒感染等可刺激自噬的發生，而ROS可以通過Atg4、過氧化物酶、線粒體電子傳遞鏈(mETC)等不同機制來誘發自噬[8,14,15]。

LC3（微管相關蛋白-3）是經典的自噬指標，以LC3 I和LC3 II兩種形式存在，其中LC3 I是非活化形式，主要存在于胞質中；LC3 II一直定位于自噬體膜上直至被溶酶體酶降解，因此是目前反映細胞內自噬水平的特異性標記蛋白[16]。Beclin 1是自噬相關蛋白之一，在自噬泡起始合成步驟中起關鍵作用，并且是BECN1/VPS34/VPS15復合物（也稱為PI3KC III）的組分[17]。由于自噬是一個動態變化的過程，因此自噬小體的增加并不能說明自噬的水平，還需要檢測自噬降解水平的標記物p62。根據文獻報道，自噬降解水平增加，p62減少[18]。觀察各組大鼠自噬標記物的表達量變化，本實驗研究發現DNP組大鼠Beclin 1、LC3 II/LC3 I蛋白含量增加，p62表達量減少，說明自噬功能增強，而使用ROS清除劑后，自噬功能減弱，行為學分析上DNP組在使用PBN后MWT明顯升高，TWL延長。這說明過多的ROS可以通過激活自噬來清除氧化的蛋白和損傷的細胞器從而利于細胞存活。由此我們可以得出一個結論，即在2型糖尿病神經病理性疼痛中，ROS過多是導致DNP發生的原因，而過多的ROS會激活自噬，自噬是一種保護機制。本文首次闡明了2型DNP中ROS與自噬之間的關系，然而自噬在本模型中具體的調控機制尚未闡明，有待進一步研究。

圖3 Western blot法檢測大鼠脊髓中LC3-I, LC3-II, Beclin 1和p62的表達 (n = 4,D)Fig.3 The expression of LC3-I, LC3-II, Beclin 1 and p62 in spinal cord by Western blot (n = 4D)

綜上所述，在2型糖尿病神經病理性疼痛中脊髓ROS增多后激活自噬，這有助于發現新的治療靶點。

圖4 免疫熒光染色顯示Beclin 1主要定位于脊髓背角小膠質細胞和星形膠質細胞上 Scale bar = 50 μmFig.4 Immunofluorescence staining showed that the major Beclin 1 (red) co-localizes with microglia (IBA, green) and astrocyte(GFAP, green).Scale bar = 50 μm