新型內質網應激誘導蛋白 TRIM25 在乳腺癌細胞中的作用研究

陶詩詩 陳 亮

1(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

2(中國科學院大學 北京 100049)

1 引 言

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，因其術后復發和惡性轉移率高已成為危害女性健康的最主要的疾病之一[1]。多方面研究表明，全球范圍內乳腺癌的發病率迅速增加。就中國而言，每年新增患者數量和死亡數量分別占全世界的 12.2% 和 9.6%[2]。經過不斷研究，目前已經篩選出許多腫瘤相關基因，并對其生物功能進行了深入探索，這使得人們對乳腺癌的發病機制有了更多了解[3]。盡管早期乳腺癌術后 5 年生存率可達 80%[2]，但術后的遠端復發和肺轉移使乳腺癌總生存率并不樂觀。隨著全基因組測序技術的成熟、精準醫療概念的提出以及腫瘤靶向藥物的應用，臨床上乳腺癌的診斷和治療都取得了一定進展。靶向治療已逐步替代以手術、化療、放療為主的治療方案，同時原來的經驗治療也正朝個體化治療方向發展。因此，進一步挖掘乳腺癌細胞生長和轉移過程中的標志性癌基因，并揭示其在乳腺癌發生發展中的調控機制是這種新治療模式發展的關鍵所在，這將為完善乳腺癌基因靶點治療策略奠定基礎。

內質網是維持細胞正常功能的重要細胞器，人體 1/3 蛋白質都是在內質網中合成的，同時它也是蛋白質修飾和運輸的主要場所[4-5]。當內質網受到缺氧或營養缺失等某些刺激時，會發生功能紊亂，從而導致蛋白錯誤折疊，這種現象稱為內質網應激[6]。內質網應激會啟動一系列信號通路，其中未折疊蛋白反應(Unfolded Protein Response，UPR)是被激活的主要調控機制之一。它通過促進錯誤折疊蛋白快速降解，反饋調節內質網功能，在一定程度上減弱內質網應激并逐漸恢復內質網穩態[7-8]。其中，內質網穩態對于維持細胞的正常生理功能至關重要。研究發現，雖然實體腫瘤通常處于長期慢性缺血、缺氧等應激微環境中，但卻能正常存活和增殖。這是由于大部分腫瘤細胞已進化出應對內質網應激的更強能力，它們通過加速細胞內錯誤折疊蛋白的降解來恢復內質網穩態從而促進自身存活[9]。

TRIM(Tripartite Motif Family Protein)家族蛋白又被稱為三基序蛋白，目前人們已經發現的 TRIM 家族蛋白質有 70 多種。該家族成員的 N 端都有一個保守的鋅指結構域，使得大多數 TRIM 家族蛋白具有 E3 泛素連接酶活性，因此它們主要通過調控目的蛋白降解發揮功能[10-11]。由于內質網應激時會產生大量錯誤折疊蛋白，因此推測 TRIM 家族蛋白很可能參與內質網應激，并通過降解這些錯誤折疊蛋白發揮其調控作用，從而影響細胞存活。此外，許多研究表明 TRIM 家族蛋白與腫瘤的發生發展密切相關，如 TRIM33 可降解細胞核中β-catenin 蛋白達到抑癌效果[12]；TRIM24 通過激活癌基因的轉錄促進前列腺癌發展[13]；TRIM37 在乳腺癌中通過參與單泛素化過程調控組蛋白表達發揮功能[14]。本文作者團隊的研究[15-16]發現，TRIM 家族蛋白中的 TRIM11 能夠增強腫瘤細胞中的錯誤折疊蛋白和聚集體降解，最終導致腫瘤發生。據此進一步推測在腫瘤細胞中，TRIM 家族蛋白可能通過參與內質網應激來影響細胞的存活，最終實現調控腫瘤生長的目的。但目前關于 TRIM 家族蛋白在內質網中的作用幾乎未知，僅有一次關于TRIM13 能夠定位到內質網并參與內質網相關蛋白降解(Endoplasmic Reticulum Associated Protein Degradation，ERAD)過程的報道[17]，而該蛋白如何發揮功能的作用機制尚未有相應研究。

本文作者團隊就此對 TRIM 家族蛋白進行了內質網應激表達變化篩選發現，與對照組相比，TRIM25 在內質網應激時表達水平顯著上調，因此將 TRIM25 鎖定為研究目標，并推測TRIM25 是內質網應激的負反饋調節因子，擬探究敲低 TRIM25 對乳腺癌細胞的影響。TRIM25也叫雌激素受體指蛋白(Estrogen-Responsive Finger Protein，EFP)，它在細胞中的表達受雌激素調控，并參與雌激素相關腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌及子宮內膜癌的發生發展過程。統計表明，TRIM25 的高表達與乳腺癌不良預后密切相關[18-20]。因此，本研究旨在通過研究TRIM25 對乳腺癌細胞 MCF7 內質網應激過程的影響并分析其與乳腺癌患者預后的關系，為發現新的乳腺癌治療靶點提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 材料

人源乳腺細胞 MCF 10A、MCF7、MDAMB-231 均購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)；二甲基亞砜(DMSO)、霍亂毒素(Cholera Toxin，CTX)、毒胡蘿卜素(Thapsigargin，TG)和衣霉素(Tunicamycin，TM)均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培養基、磷酸鹽緩沖液均購自美國 Hyclone 公司；胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國 Gibco 公司；DMEM/F12 培養基和 MEGM SingleQuots? 試劑盒購自瑞士 Lonza 公司；馬血清購自美國 Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑購自北京全式金生物技術有限公司，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細胞裂解液 RIPA 購自上海碧云天生物技術公司；蛋白酶抑制劑苯甲基硫酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF)購自上海羅氏制藥有限公司；磷酸酶抑制劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；lipofectamine 3000轉染試劑購自美國 Invitrogen life 公司；TRIM25抗體、ER stress antibody kit 均購自美國 CST(Cell Signaling Technology)公司；β-tubulin、HRP antimouse 和 HRP anti-rabbit 抗體均購自 Proteintech中國公司；FITC 凋亡檢測試劑盒購自美國BD(Becton，Dickinson and Company)公司。ECL化學發光儀(GE，Amersham Imager AI600)；CO2細胞培養箱(美國 Thermo Scientific 公司)；細胞操作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 細胞培養

本實驗選用 MCF 10A、MCF7、MDAMB-231、293T 細胞開展實驗。其中，MCF7 10A 用含 5% 馬血清、MEGM SingleQuots? 試劑以及 100 ng/mL 霍亂毒素的 DMEM/F12 培養基進行培養；其余細胞均用含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 高糖培養基進行培養，培養條件為 37 ℃、5% CO2。

2.2.2 內質網應激時 TRIM25 表達量的檢測

為研究 TRIM25 蛋白在乳腺癌細胞 MCF7 處于內質網應激時的表達變化情況，分別從 mRNA和蛋白水平進行檢測。首先，將 MCF7 細胞以60% 的密度接種于 6 孔板中，培養過夜后，分別替換為含 DMSO、5 μg/mL TM、1 μmol TG 的培養基，并繼續培養 6 h。然后，棄去培養液，加適量磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution，PBS)洗去殘余培養液，隨后每孔加 1 mL Trizol，室溫放置 5 min，使細胞充分裂解后，將細胞裂解液轉移至 RNAse-free 的 1.5 mL 離心管提取 RNA。另外，設置同上處理的 3 個孔，加DMSO、TM 及 TG 后繼續培養 12 h，棄去培養液，加適量的 PBS 洗去殘余培養基，之后每孔加 500 μL PBS，小心將細胞刮下并將細胞液轉移至新的 1.5 mL 離心管中，提取蛋白。最后，分別采用實時熒光定量 PCR 和蛋白免疫印跡檢測各組 TRIM25 表達量。

2.2.3 敲低 TRIM25 對內質網應激及 UPR 信號通路影響的檢測

(1)穩定敲低 TRIM25 的 MCF7 細胞系構建

本實驗使用 PLKO.1、VSVG、DR8.91 慢病毒體系進行基因敲低。首先，設計 TRIM25 的短發夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)，并將shRNA 插入表達載體 PLKO.1 以構建 PLKO.1-shRNA 重組質粒。然后，包裝慢病毒，將 293T細胞以 60% 密度接種于 10 cm 培養皿中，培養12 h 后，質粒 PKOL.1/PLKO.1-shRNA、VSVG、DR8.91 按質量比為 9∶1∶10 轉染 293T 細胞，培養 18 h 更換成 7 mL 含 30% 血清和 1% 雙抗的DMEM 培養基，并繼續培養 24 h(此過程大量病毒將被分泌到培養基中)。最后，收集培養液以1 250 r/min 在 4 ℃ 下離心 5 min，上清液使用45 μm 濾膜過濾收集濾液至無菌儲存管中。至此病毒液收獲完成，可繼續換液收病毒 1～2 次。

接下來，用上述包裝好的病毒感染 MCF7細胞，并用含嘌呤霉素的培養基篩選穩定轉染細胞系。具體地，先將 MCF7 細胞以 60% 密度接種于 6 孔板中，培養過夜，棄培養液，每孔加入 1 mL 培養基、1 mL 病毒液、8 μg/mL polyberen，感染 24 h。然后，換成含 1.5 μg/mL嘌呤霉素的培養基進行篩選培養，每天換液，連續篩選 4 天(此過程成功感染的細胞將會存活)，再換成含 0.015 μg/mL 嘌呤霉素的培養基擴大培養存活細胞。最后，通過實時熒光定量 PCR和蛋白免疫印跡分析該細胞系中 TRIM25 表達情況。同時，將經驗證的正常表達 TRIM25 對照組(sh Negative Control，shNC)和穩定敲低TRIM25(shTRIM25-1、shTRIM25-2)的 MCF7 細胞系繼續培養，便可用于后續實驗。

(2)內質網應激下游基因表達及 UPR 信號通路的檢測

分別從上述構建的 MCF7 細胞系中提取RNA 和蛋白質，在 mRNA 水平檢測內質網應激情況及 UPR 信號通路下游基因表達，并在蛋白質水平檢測 UPR 信號通路中的關鍵蛋白。比較shNC、shTRIM25-1、shTRIM25-2 中各基因及蛋白的表達變化，并分析 TRIM25 敲低對內質網應激和 UPR 信號通路的影響。

2.2.4 細胞凋亡檢測

為研究 MCF7 細胞中敲低 TRIM25 對內質網應激誘導的細胞凋亡的影響，將 shNC、shTRIM25-1、shTRIM25-2 以 60% 的密度接種于12 孔板中，培養過夜后分別替換為含 DMSO、5 μg/mL TM、1 μmol TG 的培養基，繼續培養12 h。隨后收集細胞，按 FITC 凋亡檢測試劑盒說明書操作，同時設置 3 個補償實驗組：空白對照(不染)、50 μmol H2O2處理 12 h(單染 FITC)、65 ℃ 水浴 20 min(單染 PI)，通過流式細胞分析儀檢測各組細胞凋亡率。

2.2.5 不同乳腺細胞系中 TRIM25 表達量的檢測

分別提取 MCF 10A、MCF7、MDA-MB-231細胞蛋白質，通過蛋白免疫印跡檢測各細胞系中TRIM25的蛋白表達水平。

2.2.6 TRIM25 與乳腺癌患者生存期相關性的分析

通過在線數據庫 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)查詢正常乳腺組織和原位乳腺癌組織樣本中TRIM25的蛋白量表達差異；隨后通過在線分析數據庫 SurvExpress((http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp)查詢乳腺癌患者的生存期與 TRIM25表達量的關系。進一步探討 TRIM25 表達水平的高低與乳腺癌及乳腺癌患者生存期相關性。

2.2.7 統計學分析

使用 SPSS17.0 軟件處理實驗數據，實驗結果均以“平均值±標準差”表示，組間差異采用雙側t檢驗進行分析。其中，** 表示P＜0.01；*** 表示P＜0.001。

3 結果與分析

3.1 內質網應激誘導乳腺癌細胞 MCF7 中 TRIM25蛋白表達上調

本實驗使用內質網應激陽性誘導劑 TM 和TG 處理 MCF7 細胞 6 h 以誘導細胞產生內質網應激，同時將 TM、TG 的溶劑 DMSO 作為對照處理同樣時間，收集細胞檢測 TRIM25 和內質網應激標志物葡萄糖調節蛋白 78(78 kDa Glucose-Regulated Protein，GRP78/Bip)的 mRNA 水平。由圖 1(a)可知，與 DMSO 處理組相比，TM、TG 處理組內質網應激標志物 GRP78/Bip mRNA水平顯著上升，同時 TRIM25 mRNA 水平也顯著上升。此外，由于蛋白表達比 mRNA 變化反應慢，故從 TM、TG 處理細胞 12 h 后收集細胞檢測 TRIM25 和內質網應激標志物 GRP78/Bip的蛋白水平可知(如圖 1(b))，與 DMSO 處理組相比(以β-tubulin 為內參)，TM、TG 處理組內質網應激標志物 GRP78/Bip 蛋白水平大幅上升，同時 TRIM25 蛋白水平也大幅上升。以上結果表明，內質網應激情況下，乳腺癌細胞MCF7 可誘導 TRIM25 mRNA 和蛋白表達水平顯著上升。

3.2 TRIM25 敲低誘導內質網應激并激活 UPR信號通路

通過實時熒光定量 PCR 檢測 MCF7 細胞系穩定敲低 TRIM25 的效果。由圖 2(a)可知，與 shNC 相比，shTRIM25-1 和 shTRIM25-2 中TRIM25 的 mRNA 表達水平顯著降低；直接反映細胞內質網應激程度的 GRP78/Bip 水平顯著上升，表明在 MCF7 中敲低 TRIM25 可誘導細胞產生內質網應激。

圖1 內質網應激時 TRIM25 在乳腺癌細胞 MCF7 中的表達變化Fig.1 Changes of TRIM25 expression in breast cancer cells MCF7 under ER stress

圖2 TRIM25 敲低對內質網應激及 UPR 信號通路下游基因表達的影響Fig.2 Effects of TRIM25 knockdown on ER tress and expression of downstream gene in UPR signaling pathway

未折疊蛋白反應(UPR)是由內質網應激所激活的一種內質網蛋白質量控制體系。該體系相關信號通路的活化，能夠反饋調節內質網功能，對于恢復內質網穩態具有重要作用。通過檢測 UPR信號通路中sXBP1、ATF4、CHOP基因的 mRNA水平發現，與對照組相比，敲低 TRIM25 后這 3個基因的 mRNA 表達顯著升高(圖 2(b))。該結果表明，乳腺癌細胞 MCF7 中敲低 TRIM25 可激活 UPR 信號通路。

3.3 TRIM25 敲低促進 UPR 通路關鍵蛋白的激活

通過免疫印跡，初步檢測上述 TRIM25 穩定敲低細胞系中 UPR 信號通路關鍵蛋白的變化。結果顯示，內質網應激標志蛋白 GRP78/Bip 明顯上調，UPR 通路下游的磷酸化 eIF2α上調但總eIF2α不變，磷酸化 JNK 明顯上調而總 JNK 無明顯變化(圖 3)，表明 TRIM25 蛋白敲低后明顯激活 eIF2α及 JNK 等 UPR 關鍵信號通路。該結果進一步說明 TRIM25 的缺失能夠誘導內質網應激并激活 UPR 通路。

3.4 TRIM25 敲低顯著促進內質網應激誘導的細胞凋亡

圖3 TRIM25 敲低對 UPR 信號通路關鍵蛋白表達的影響Fig.3 Effects of TRIM25 knockdown on expression of the key protein in UPR signaling pathway

內質網應激誘導的細胞凋亡是一條重要的細胞凋亡途徑，而 JNK 是目前已知的促進內質網凋亡途徑的關鍵分子之一。由上述結果推測，敲低 TRIM25 很可能參與內質網應激誘導的細胞凋亡。本文使用 DMSO、TM 及 TG 分別處理TRIM25 敲低細胞系，12 h 后通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。結果顯示，與對照組相比，TRIM25 的缺失導致 DMSO 處理的細胞凋亡率顯著增高，并能導致內質網應激藥物處理的細胞凋亡率有極顯著上升(如圖 4)，表明敲低TRIM25 顯著促進內質網應激誘導的乳腺癌細胞MCF7 凋亡。

圖4 TRIM25 敲低對內質網應激誘導細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of TRIM25 knockdown on endoplasmic reticulum stress induced cell apoptosis

3.5 乳腺原發上皮轉化為乳腺癌細胞過程伴隨TRIM25 蛋白水平上調

通過免疫印跡檢測不同乳腺細胞系 MCF 10A、MCF7 和 MDA-MB-231 中 TRIM25 的蛋白水平。其中，MCF 10A 為正常乳腺上皮細胞；MCF7 為原位乳腺癌細胞；MDA-MB-231 為惡性高轉移乳腺癌細胞。結果表明，乳腺原發上皮轉化為乳腺癌細胞過程伴隨 TRIM25 蛋白水平上調(如圖 5)，提示 TRIM25 蛋白在乳癌細胞癌性轉化過程中發揮重要功能。

圖5 不同乳腺細胞中 TRIM25 的表達量差異Fig.5 The expression of TRIM25 in different breast cells

3.6 TRIM25 高表達顯著降低乳腺癌病人生存期

利用 CPTAC 數據庫查詢正常乳腺組織和原位乳腺癌組織中TRIM25的蛋白表達量并分析發現：與正常組織(n＝18)相比，TRTM25 在原位乳腺癌組織(n＝125)中的表達水平有顯著性上調(P＜0.001)，如圖 6(a)所示。

此外，為分析 TCGA 數據庫中浸潤性乳腺癌患者 TRIM25 表達量與生存期的關系，將患者分為 TRIM25 高表達(n＝481)和低表達(n＝481)兩組，并比較兩組間患者的總生存率。結果顯示，在 TRIM25 高表達組中乳腺癌患者的生存期顯著降低(圖 6(b))，表明 TRIM25 的表達水平與乳腺癌病人的生存期負相關。

圖6 生物信息學分析 TRIM25 表達量與乳腺癌患生存期關系Fig.6 Bioinformatics analysis of TRIM25 expression and survival of breast cancer patients

4 討 論

乳腺癌的發病過程是極其復雜的，雖然靶向治療給乳腺癌患者帶來了極大的希望，但由于人們對其分子機制的研究至今仍處于探索階段。目前可作為臨床診斷、靶向治療以及預后標志的有效分子靶點還很缺乏，因此尋找新的乳腺癌關鍵基因是乳腺癌研究的重要內容。

目前，大部分研究焦點集中在那些可能與乳腺癌發生發展直接相關的靶基因上，希望能尋找到新的治療靶點，為臨床治療提供新思路。近來內質網應激誘導腫瘤細胞凋亡逐漸成為一個新的研究方向，揭示該過程中重要蛋白的作用引起了人們的關注。已有報道稱 TRIM13 定位于內質網，在內質網應激過程中通過其螺旋卷曲結構域誘導細胞自噬[21]，但 TRIM 家族其他成員參與內質網應激過程還未有相關報道。本文利用內質網應激誘導陽性藥物 TM、TG 體外處理細胞，通過實時熒光定量 PCR 檢測發現多種 TRIM 家族蛋白在內質網應激時表達量有顯著變化，其中TRIM25 變化尤為顯著，因此推測 TRIM25 是參與內質網應激過程的重要蛋白。故設計圖 7(a)實驗思路探究 TRIM25 與乳腺癌發生發展的關系。

大量研究表明，TRIM25 所屬的 TRIM 家族蛋白與腫瘤的發展密切相關。例如，TRIM11 高表達可增強腫瘤細胞降解錯誤折疊蛋白的能力，從而促進腫瘤細胞存活[16]；TRIM28 在早期肺癌中具有抑制腫瘤細胞增殖的功能[22]；TRIM32 通過負調節 p53 功能促進腫瘤發生[23]。TRIM25 同樣在多種腫瘤的發生中扮演著重要角色，如促進胃癌[24]、肺癌[25]的發展。此外，更有多項研究表明，TRIM25 作為一種雌激素受體，參與調節雌激素相關腫瘤的進展，與乳腺癌的關系尤為密切。在乳腺癌惡化過程中，TRIM25 的表達量顯著上調促進其靶蛋白腫瘤抑制因子 14-3-3σ的水解，從而加劇乳腺癌的惡性轉化[26-27]。有報道稱 TRIM25 是一個轉錄調控因子，其活性的改變在一定程度上決定了乳腺癌的轉移表型。Walsh等[28]通過系統生物學方法確定了 TRIM25 是乳腺癌轉移的關鍵決定因素。以上研究暗示 TRIM25在乳腺癌的臨床治療中具有潛在的重要性，這與本文的研究結果一致，但目前關于 TRIM25 如何調節乳腺癌進展的分子機制尚不清楚。因此，揭示 TRIM25 與乳腺癌之間的新型調控機制，可為未來臨床上乳腺癌的早期診斷和臨床治療提供新思路和理論支持。

圖7 實驗流程及 UPR 信號通路示意圖Fig.7 The diagram of experemental scheme and UPR signaling pathway

本文研究發現，TRIM25 是一種新型的內質網應激誘導蛋白。當乳腺癌細胞 MCF7 處于內質網應激時，其表達顯著上調。此外，TRIM25 敲低會誘導內質網應激、激活 UPR 信號通路并顯著促進內質網應激誘導的 MCF7 細胞凋亡(如圖 7(b))。生物信息學分析表明，TRIM25 高表達與乳腺癌患者的生存率較低相關。鑒于以上結果，初步判斷 TRIM25 參與內質網應激調節乳腺癌細胞生長，有望成為乳腺癌臨床診斷的指標和治療的新靶點。

本研究也存在一定局限性，如只檢測了TRIM25 敲低對乳腺癌細胞的影響，缺少對TRIM25 過表達的研究。有報道稱在前列腺癌的研究中發現，TRIM25 靶向 ERG(轉錄因子家族Ets 相關基因)癌基因，使該基因發生多聚泛素化降解[29]。這表明 TRIM25 在各種癌癥中的作用具有兩面性，可作為癌基因也可以作為抑癌基因發揮作用；檢測 TRIM25 對細胞凋亡影響的同時還可檢測對細胞遷移、侵襲能力的影響。因此，要更深入探明 TRIM25 的生物學功能還需進一步研究。

5 結 論

TRIM25 是一種新型的內質網應激誘導蛋白，它可通過參與內質網應激誘導細胞凋亡來調控乳腺癌細胞的存活，這是一種新的腫瘤細胞調控體系。其中，隨著乳腺癌細胞惡性程度的加劇，TRIM25 表達量顯著上升，導致乳腺癌患者生存率明顯降低。本研究結果提示，TRIM25 與乳腺癌的發生發展有密切關系，有望成為乳腺癌治療和預后的潛在靶點。