功能化納米探針用于腦膠質瘤精準診療研究進展

盛宗海 李三清,2 胡德紅 高篤陽 鄭海榮

1(中國科學院深圳先進技術研究院生物醫學與健康工程研究所 深圳 518055)

2(中國人民解放軍空降兵軍醫院檢驗科 武漢 430012)

1 引 言

腦膠質瘤是一種嚴重危害人類健康的中樞神經系統重大腦疾病，具有發病率高、復發率高、死亡率高和治愈率低的“三高一低”特點[1-3]。腦膠質瘤細胞通常沿神經纖維生長并向周圍腦區彌散，具有極高的侵襲性。這種獨特的生長方式使得腦膠質瘤細胞和腦正常細胞無明顯邊界，手術難以徹底切除，術后極易復發。此外，大腦天然的防御系統——血腦屏障嚴重阻礙了化療藥物和成像探針穿過腦血管進入腦組織中，導致治療和成像效果不佳。因此，迫切需要發展新的成像探針、成像方法以及新型的治療藥物和方法用于腦膠質瘤的精準診斷和治療。

目前，臨床上腦膠質瘤診斷方法主要有電子計算機斷層掃描(Computed Tomography，CT)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)、超聲成像、放射性核素成像和熒光成像，采用的造影劑主要有釓噴酸葡胺注射液(MRI 造影劑)、碘帕醇注射液(CT 造影劑)、微泡(超聲造影劑)、18F 標記物(核素成像造影劑)和吲哚菁綠染料(熒光造影劑)等[4-9]。這些小分子造影劑在增強造影成像的同時，也存在著一些不足，如體內循環時間短、代謝快，缺乏腦膠質瘤靶向性等。在治療方面，臨床上腦膠質瘤的主要治療手段有手術治療、放射治療、化療、光學治療以及聯合治療等[10-12]。這些方法在減緩腦膠質瘤病理進程方面發揮著重要作用，但并未明顯改善腦膠質瘤患者的五年生存期。其主要原因是：(1)手術治療難以徹底清除腦膠質瘤細胞，導致復發率很高；(2)化療藥物難以跨越血腦屏障，靶向腦膠質瘤細胞，導致藥物到達腦膠質瘤的含量極低，化療效果不佳；(3)放療和光學治療依賴腦膠質瘤微環境中氧分子的含量，但腫瘤在生長過程中會導致腫瘤內部缺氧，使得放療和光學治療效果不佳。雖然新型的治療方法，如免疫治療也已用于腦膠質瘤的臨床研究中，但其生物安全性、有效性還需進一步研究。因此，積極發展腦膠質瘤精準診療的新方法、新技術具有重要的研究價值和臨床轉化前景。

納米技術的飛速發展為腦膠質瘤的精準診療帶來了新希望[13-19]。與傳統成像探針和治療藥物相比，納米探針和納米藥物表現出以下獨特的優勢：(1)高效跨血腦屏障，特異性結合腦膠質瘤細胞。納米探針和納米藥物具有巨大的比表面積，能可控修飾多種配體分子，通過配體-受體相互作用高效跨血腦屏障，特異性結合腦膠質瘤細胞[20]。(2)多模態分子成像精準識別腫瘤邊界。納米技術能有效克服單一成像模態的不足，融合多種成像元素，實現跨尺度、多模態膠質瘤分子成像與腫瘤邊界精準識別[7]。(3)成像引導下的腦膠質瘤精準治療。納米載體可同時裝載成像分子和治療藥物，通過實時成像觀測藥物在體內的分布和代謝，實現成像引導下的腦膠質瘤精準治療[9,21]。目前，用于腦膠質瘤精準診療的納米材料主要包括無機納米顆粒、聚合物納米顆粒和無機有機雜合納米顆粒等，通過表面化學偶連抗體、多肽、核酸等靶向配體，實現探針高效跨越血腦屏障，靶向腦膠質瘤細胞。本文主要介紹國內外研究小組在納米探針用于腦膠質瘤成像和治療研究方面的工作進展，并對當前納米探針在可控制備、表面功能化修飾與臨床應用上面臨的難題進行討論與分析，同時對該領域面臨的機遇和挑戰進行總結，最終對納米技術在腦膠質瘤精準診療方面的發展方向進行展望。

2 跨血腦屏障的探針遞送方式

血腦屏障主要由腦血管內皮細胞、星型膠質細胞、周皮細胞、緊密連接層和基質膜等構成，是大腦的天然防御系統。血腦屏障在保護大腦免受有毒物質侵害的同時，也阻止了成像探針和治療藥物進入腦組織[14]。目前，臨床使用的小分子造影劑和小分子藥物主要通過細胞旁擴散、跨細胞擴散和轉運介導等方式進入腦組織。這些方式跨血腦屏障效率低，藥物和造影劑難以達到有效濃度。臨床上可通過高滲溶液，如甘露醇等使血腦屏障全部開放，提高造影劑和藥物被動擴散，進而從細胞間隙進入腦組織。但該方法無法定點開放血腦屏障，且血腦屏障開放時間不易控制。此外，還可通過緩激肽及其類似物調控腦血管內皮細胞 B2受體，破壞緊密連接層，促進造影劑和藥物跨越血腦屏障。但這種方式導致大腦血腦屏障全部開放，有毒物質也隨之進入大腦，引發癲癇等副作用。雖然有生物學家通過調節信號通路的方法可以增加造影劑和藥物進入大腦的機會，但這些方法都有嚴重的副作用，容易造成腦組織損傷。

相對于小分子造影劑和藥物而言，納米探針和納米藥物可通過吸附、受體介導的細胞轉運兩種方式高效跨越血腦屏障，特異性結合腦膠質瘤細胞[22]。這兩種選擇性跨越血腦屏障的方法具有可控性能好、安全系數高、易于臨床推廣的獨特優勢。目前，已經開發出多種高效跨血腦屏障的配體分子，包括轉運蛋白、多肽、抗體等[10,23-27]。通過化學修飾將配體分子結合到納米探針和納米藥物表面，可顯著提升其跨越血腦屏障的能力。納米探針穿越血腦屏障的分子機制包括胞外親脂性擴散、細胞旁路擴散、載體介導的轉運、受體介導的胞吞轉運及吸附介導的胞吞轉運等[28-29]。其中，受體介導的胞吞轉運是納米探針跨越血腦屏障的主要方式。通過在納米探針表面修飾特異性靶向分子，如抗體、多肽、核酸等，高效結合血腦屏障表面的受體分子，并通過細胞內吞轉運的方式，可將納米探針轉運進入腦組織。

Zhu 等[10]報道了以轉鐵蛋白作為靶向配體和小分子染料載體，通過疏水相互作用和氫鍵相互作用將臨床使用的吲哚菁綠染料高效結合到轉鐵蛋白表面，制備了一種具有診斷和治療雙功能的納米探針，并通過激光共聚焦熒光成像和免疫熒光分析證實該納米探針與腦膠質瘤細胞表面高表達的轉鐵蛋白受體特異性結合；同時，在腦膠質瘤皮下、原位裸鼠模型上，實現了轉鐵蛋白受體介導的納米探針高效跨血腦屏障、靶向結合腦膠質瘤細胞的方法學驗證。在此基礎上，Jia 等[30-31]借助于細胞膜仿生工程原理，通過提取天然來源的細胞膜并與納米脂質體載體相融合，研發出具有細胞膜功能的仿生脂質體納米探針(圖 1)。這類仿生納米探針可以模擬天然細胞的活性功能。例如，紅細胞膜修飾的納米探針可以顯著延長探針的體內半衰期；癌細胞膜修飾的納米探針通過同源靶向性可以顯著提高探針靶向同源癌細胞的能力。Jia 等[30-31]研究發現，腦膠質瘤細胞膜修飾的納米載體可通過膜蛋白的特殊功能，顯著改善探針和藥物分子的血液半衰期，增強其對同源癌細胞的靶向識別能力。Jia 等[31]在早期原位腦膠質瘤裸鼠模型上，證實了仿生納米載體可高效跨越血腦屏障，特異性結合到腦膠質瘤細胞上，實現了探針和化療藥物跨血腦屏障的靶向遞送，為腦膠質瘤的成像和治療提供了一種新方法和新技術。

圖1 仿生納米探針高效跨血腦屏障靶向腦膠質瘤近紅外熒光成像[31]Fig.1 Biomimetic nanoprobe with crossing blood-brain-barrier performance for active-target near-infrared fluorescence imaging of glioma[31]

此外，復旦大學李聰教授課題組采用化學激動劑偶連樹枝狀高分子的方法制備了一種小粒徑納米探針，借助于激動劑特異性激活腦毛細血管內皮細胞上的 A2A 腺苷受體，觸發毛細血管收縮，導致腦血管緊密連接層暫時性開啟，促進納米探針跨越血腦屏障并進入腦組織。相對于受體介導的跨血腦屏障方法，納米激動劑調控血腦屏障開放具有高效、安全、可逆的特點，為腦膠質瘤的分子成像和治療提供了新途徑[32-33]。

除了受體介導和激動劑調控跨血腦屏障兩種方法以外，國內外幾個課題組將目光聚焦在超聲開放血腦屏障的研究上。相對于生物和化學方法開放血腦屏障靶向遞送探針和藥物而言，超聲這種物理方式開啟血腦屏障具有無創、定點、可逆、安全等優點，其開放血腦屏障的機制主要涉及到超聲波產生的穩態空化效應和機械效應。前者會通過微泡的穩態空化作用增加腦內皮細胞間隙，引導血腦屏障可逆開放；后者通過刺激內皮細胞機械敏感性離子通道，增加血腦屏障的跨細胞途徑和細胞旁途徑的滲透性，引起血腦屏障的開放。2016 年，法國科學家制備了一種可植入的超聲裝置用于聯合微泡開放血腦屏障高效遞送化療藥物治療腦膠質瘤。15 例人體實驗研究結果表明，超聲開放血腦屏障后，可顯著增加化療藥物 carboplatin在腦膠質瘤細胞中的富集，實驗組中 9 例病人的腦膠質瘤停止生長，顯示出巨大的臨床應用前景[34]。Wu 等[35]也利用了超聲聯合微泡開放血腦屏障，將多空硅納米診療劑高效地遞送到腦膠質瘤細胞內，顯著抑制了腦膠質瘤細胞生長，延長了荷瘤小鼠生存期。

這些前期研究工作充分證實，選擇性可逆開放血腦屏障有助于提高腦膠質瘤精準診療效率。但是，采用化學或物理方法促進納米探針跨越血腦屏障同樣存在一些不足，例如：(1)靶向配體的合理選擇，精準化學修飾影響了探針和藥物跨血腦屏障的效率；(2)激動劑開放血腦屏障是全腦性的，難以實現血腦屏障的精準定點開放；(3)超聲開放血腦屏障需要儀器配合，尤其需要大型的影像設備如 MRI 進行引導，其生物安全性也需進一步評估。

3 多模態成像納米探針

腦膠質瘤的精準治療離不開影像學的輔助和引導。其中，術前影像診斷可定位腦膠質瘤的位置并測量其尺寸大小，術中成像顯影腦膠質瘤邊界可引導手術治療，術后監控腦膠質瘤的進展是實現腦膠質瘤精準治療的有效途徑。目前，腦膠質瘤的術前診斷主要依靠磁共振成像這種單一成像模態；術中腫瘤邊界的判定主要靠手術師的經驗和電生理的輔助；術后腦膠質瘤的復發依然采用磁共振成像進行判斷[36-37]。雖然磁共振成像具有高穿透、無輻射、空間分辨率高的優勢，但也存在一些不足，如設備體積龐大，難以在術中實時引導手術治療，也難以實現從細胞到人體的跨尺度分子成像，故尚未能實現診斷和治療一體化。相對于單一成像模態而言，多模態成像融合了多種成像元素，可以有效克服單一成像模態的不足，實現優勢互補。腦膠質瘤的診斷遵循多參數成像診斷的原則，通過磁共振、CT、超聲和正電子發射斷層掃描(Positron-Emission Tomography，PET)等多種成像技術，可以顯著提高腦膠質瘤診斷的精準性，更加有效地引導腦膠質瘤手術治療。但這種多次診斷的方式比較耗時耗力，對醫院設備要求較高，極大地增加了病人的經濟負擔。相對于臨床常用的多種成像技術聯合診斷腦膠質瘤而言，基于納米探針的腦膠質瘤多模態成像技術具有獨特的優勢——能有效避免多次注射造影劑進行多次復雜成像，易與臨床使用的 PET/CT 和 PET/MRI 等多模態成像設備融合，有望實現腦膠質瘤術前診斷、術中引導和術后評估一體化[38-39]。

國內外幾個課題組在該領域開展了卓有成效的研究工作，取得了重要的研究進展。例如，2012 年，美國斯坦福大學分子影像中心 Gambhir教授團隊首次提出了腦膠質瘤精準診療的新概念，制備了一種金/硅核/殼結構的多模態納米探針：在小鼠原位腦膠質瘤模型上首次實現了MRI、光聲、拉曼三模態分子成像，證明光聲和拉曼成像技術可以輔助手術師在術中精準識別腦膠質瘤邊界，并在術后評估殘余病灶，這表明多模態納米探針在腦膠質瘤精準診療中具有巨大應用潛力[40]。Wu 等[35]采用易合成、生物相容性好、表面易功能化的介孔二氧化硅作為納米載體，內核裝載具有磁共振造影能力的 Fe3O4納米顆粒后，在其表面修飾具有光聲成像功能的超小 Cu2?xSe 納米顆粒，構建了一種多模態納米探針，實現原位腦膠質瘤磁共振成像和光聲雙模態成像，展示了多模態納米探針在腦膠質瘤精準診療中的巨大應用潛力。在此基礎上，Wu 等[36]借助于中性粒細胞這種炎癥趨化的細胞載體，裝載具有熒光和磁共振成像能力的吲哚菁綠分子和四氧化三鐵納米顆粒，實現了術后腦膠質瘤的磁共振和熒光雙模態分子成像以及殘留腦膠質瘤細胞的治療。之后，Sheng 等[39]針對當前多模態納米探針制備過程繁瑣、表面難以修飾的難題，研發了單一材料、多種成像功能的新型多模態納米探針，在 C6 腦膠質瘤小鼠模型上實現了高分辨(38 μm)、高信背比(S/N＝4.4)的腦膠質瘤近紅外二區熒光和近紅外一區光聲雙模態分子成像。該研究通過兩種互補的術中成像模態精準識別腦膠質瘤邊界，為成像引導腦膠質瘤精準手術治療提供了一種全新的方法和技術(圖 2)。

圖2 近紅外二區納米探針用于腦膠質瘤的近紅外二區熒光和光聲雙模態成像[39]Fig.2NIR-II nanoprobe for NIR-II fluorescence and photoacoustic dual-modal imaging of glioma[39]

此外，國內外其他研究小組也在多模態納米探針領域開展了相關研究工作，并在腦膠質瘤術中邊界診斷方面取得了重要的研究進展。例如，中國科學院自動化研究所田捷研究員團隊通過微乳液方法制備了一種以金納米棒為核、金屬有機框架材料為殼的多功能納米探針，在小鼠模型上實現了腦膠質瘤的 MRI、CT 和光聲三模態分子成像[41]。美國國立衛生研究院陳小元教授課題組以天然的鐵蛋白為核，通過偶連放射性元素64Cu和熒光染料，制備了具有熒光和 PET 成像功能的多模態納米探針，并利用鐵蛋白靶向功能實現了腦膠質瘤的 PET 和熒光雙模態分子成像[42]。

多模態納米探針在腦膠質瘤成像中的成功應用，一方面，能夠實現更加精準的疾病診療；另一方面，可以減輕多次注射造影劑帶來的用藥痛苦，降低毒副作用和造影劑交叉使用帶來的感染，節約醫療費用。但在開發這種多模態納米探針的過程中，還存在著諸多挑戰：(1)制備過程復雜，體內生物相容性和可代謝性有待深入研究；(2)納米探針的成像應用集中在小鼠模型中，在大動物和靈長類動物中的研究還很少；(3)多模態納米探針的臨床轉化還需深入研究。

4 診療一體化納米探針

診斷與治療融為一體是實現腦膠質瘤精準診療的重要研究方向。傳統的醫學成像和治療通常是獨立的兩個部分。診斷所用的造影劑和治療所用的化療藥物在不同時間、注射不同的藥劑量到患者體內，發揮的功效也不同。采用這種先診斷后治療的模式，無法實時觀測化療藥物在患者體內的分布和代謝過程，短時間內難以評估化療藥物療效，也難以突破化療藥物產生的多藥耐藥和對正常器官的毒性。因此，迫切需要發展融合診斷與治療一體化的技術，實現可視化的腦膠質瘤精準治療。臨床采用的放射性治療藥物在發揮治療功能的同時，也具有成像功能。但由于放射性治療劑量較高，副作用明顯，限制了其成像功能的應用。納米技術為腦膠質瘤診療一體化提供了強大的技術支撐。通過功能化納米載體，能夠可控地制備出具有成像和治療功能的納米顆粒，通過成像實時觀測納米顆粒在體內的循環、代謝、分布，評估納米顆?？缪X屏障靶向腦膠質瘤細胞的效率，監控化療藥物的治療效果，評估化療藥物的毒副作用[43]。

近年來，國內外幾個課題組率先開展了診療一體化納米探針的研究工作。例如，Cui 等[20]采用磁靶向和轉鐵蛋白受體結合肽 t7 介導的主動靶向傳遞策略，將裝載化療藥物紫杉醇、姜黃素和磁共振造影劑的氧化鐵納米顆粒共包封在 t7修飾的磁性聚合物囊泡體系中；通過聯合用藥誘導細胞凋亡和抑制細胞周期的機制，對腫瘤生長具有協同抑制作用，其療效明顯優于單一用藥；在原位膠質瘤模型的研究中，通過熒光成像、同步輻射 X 線成像和 MRI 觀察該顆粒在腦膠質瘤中的蓄積過程和動態變化。這種雙靶向、共給藥策略為成像引導腦膠質瘤精準治療提供了一種潛在的新方法。Gholami 等[44]采用離子凝膠法制備了一種共載超順磁氧化鐵和阿霉素的殼聚糖聚合物囊泡，并用于 MRI 引導的腦膠質瘤化療，在膠質母細胞瘤的診斷和治療方面具有很好的應用前景。Xu 等[21]報道了一種共同裝載抗癌藥物、超順磁氧化鐵和量子點的具有診斷和治療功能的脂質體納米顆粒，在小鼠模型上實現了磁靶向的腦膠質瘤熒光成像和 MRI 雙模態成像，并引導腦膠質瘤手術的治療和化療。Duan 等[38]將金納米棒、介孔二氧化硅、量子點和具有環糊精內核的聚合物一起裝載阿霉素和基因的多功能納米平臺，在腦膠質瘤小鼠模型上，驗證了多功能納米探針的 CT 和光聲成像能力，通過多模態成像引導小鼠腦膠質瘤的聯合治療。Ghorbani 等[45]制備了一種生物相容性較好的磁靶向載姜黃素的氧化鐵納米復合材料，通過 MRI 成像引導腦膠質瘤化療，取得了良好的效果。Ruan 等[46]將裝載阿霉素和熒光染料 Cy5.5 的金納米顆粒與明膠載體結合得到靶向腦膠質瘤的復合納米顆粒，實驗證明了該顆?？梢詫崿F藥物的靶向遞送，具有較高的腫瘤組織穿透能力和滲透性。Tsai 等[47]制備了靶向肽修飾的共載光敏劑 mTHPC 和染料 IR-780 的聚合物包載的上轉化有機無機雜化納米顆粒。該納米顆粒能夠引導顆粒穿越血腦屏障，并選擇性地將雙光敏劑遞送到腦星形細胞瘤腫瘤，用于光熱/光動力聯合治療，其聯合治療效果達到 80% 左右。

Guo 等[9]研發了一種集光聲成像與光熱消融治療于一體的靶向納米探針(圖 3)。該探針具有良好的生物相容性、超好的光學穩定性、強烈的近紅外二區光學吸收和較高的光熱轉換效率。通過高靈敏、高分辨、大深度近紅外二區光聲分子成像，實時觀測到納米探針在腦膠質瘤組織中的富集過程，可清晰地識別腦膠質瘤組織和腦正常組織的邊界(最佳成像信背比＝90)；在光聲成像的引導下，采用低劑量、高穿透的 1 064 nm 激光局部照射腦膠質瘤細胞，通過納米探針將光能轉化為熱能，選擇性殺滅腦膠質瘤細胞。這種獨特的光學成像和局部光熱消融治療一體化的診療新模式有望實現腦膠質瘤的精準診療。在此基礎上，Wu 等[35]通過熒光共振能量轉移技術，制備了熒光/光聲雙模態診療一體化納米探針，實現了腦膠質瘤的熒光/光聲雙模態成像、成像引導局部光熱消融治療及治療溫度的實時監控。這些重要的研究進展為腦膠質瘤精準診療一體化的發展提供了新思路。但這類診療成像與治療一體化納米探針的研究也同樣存在諸多挑戰。例如，成像探針和治療藥物融合到單一的納米顆粒上勢必增加納米顆粒制備步驟，這意味著增加制備成本，影響其臨床轉化應用。同時，成像分子和治療藥物在體內具有不同的代謝過程和體內半衰期，如何精準調控二者的體內行為實現協同還面臨巨大挑戰。

圖3 共軛聚合物納米探針用于近紅外二區光聲成像引導腦膠質瘤光熱治療[9]Fig.3 Conjugated polymer nanoprobe for NIR-II photoacoustic imaging-guided photothermal therapy of glioma[9]

5 小結與展望

本文總結了近年來國內外研究小組利用功能化納米探針在腦膠質瘤精準診療一體化方面的研究進展，重點介紹了納米探針跨血腦屏障、多模態納米探針識別腫瘤邊界、診療一體化納米探針三方面的工作。雖然納米技術突破了傳統診療技術的瓶頸，為腦膠質瘤的精準診療提供了新工具，但納米探針在進一步臨床應用和轉化過程中也面臨諸多挑戰。首先，納米材料在體內的生物安全性是影響其臨床轉化的關鍵性問題?，F有的納米載體系統大多都未被國家食品藥品監督管理局正式批準，也未進行相關人體實驗研究，潛在的生物毒性還需進一步研究。其次，納米探針的大規?？煽刂苽浼夹g是其臨床轉化的關鍵環節，如何控制納米探針的尺寸范圍、表面結構、靶向分子數量等關鍵指標對于實現探針的臨床轉化極為重要。最后，納米探針真正走入臨床還需要化學家、生物學家、醫學家、工程師的聯合攻關，并通過多學科合作共同推動納米探針進入臨床，造福腦膠質瘤患者。