外泌體在乳腺癌診治中的研究進展

梅兆玲， 周文輝， 馮 景

（1.安徽理工大學醫學院，安徽 淮南 232001；2.安徽理工大學附屬奉賢醫院檢驗科，上海 201499）

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，居我國女性惡性腫瘤發病率的首位[1]。乳腺癌的早期診斷與治療能夠顯著改善乳腺癌患者的生存質量，并延長其生存時間。乳腺癌的常規治療方式主要為外科手術、放化療及生物靶向治療。雖然基于眾多腫瘤標志物的新型靶向抗腫瘤藥物逐漸被應用于臨床，但乳腺癌的早期轉移與復發仍是威脅乳腺癌患者生存的主要原因[2]。近年來，由于外泌體具有良好的生物相容性、固有循環屬性、膜蛋白靶向性以及強大的物質攜載屬性，在腫瘤的診療中備受矚目。本文就外泌體在乳腺癌診療中的研究進展作一概述，旨在進一步探討外泌體作為乳腺癌早期診斷指標和治療載體的可行性。

1 外泌體的形成及功能

外泌體是由大多數細胞分泌產生的直徑為30～100 nm的脂質雙層小囊泡，囊泡內含有豐富的核酸[DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、信使RNA等]、蛋白質及脂質等物質[3]。外泌體廣泛存在于體液（血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等）中，其內容物的確切成分主要取決于分泌細胞[4]。通過特異性內容物的靶向遞送，外泌體在改變細胞行為、介導細胞信號交流中發揮重要作用[5]。在乳腺癌中，腫瘤細胞釋放的外泌體在乳腺癌細胞增殖、自我更新、干性維持、腫瘤耐藥、微環境調控以及腫瘤轉移和復發中發揮重要的驅動作用[6]。

2 外泌體在乳腺癌早期診斷中的作用

乳腺癌的診斷主要依賴于體格檢查、影像學檢查、病理檢查及血清學標志物檢測，但這些診斷方法受瘤體大小、病理分型及特異性的限制，而且還可能會對患者的身體產生不良影響。因此，尋找無創、敏感性與特異性更好的乳腺癌早期診斷新型生物標志物成為當前的研究熱點。乳腺癌患者發病后，機體會大量合成并分泌外泌體，外泌體中包含多種具有乳腺癌細胞特異性的蛋白質、miRNA及長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等物質，并且廣泛存在于患者的血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等體液中。因此，乳腺癌外泌體可以作為乳腺癌早期診斷的有效標志物。在蛋白水平，除發揮正常生物學功能的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP90外，外泌體所攜帶的腫瘤抗原[人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、癌胚抗原、gp100蛋白等]及死亡受體蛋白（FasL、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體等）對于乳腺癌的診斷及預后監測均具有重要的參考價值[7-11]。在核酸水平，與健康女性比較，乳腺癌患者體液來源的外泌體中，miRNA-21、miRNA-155、miRNA-1246、miRNA-101、miRNA-372的表達量明顯升高，且與乳腺癌不良預后顯著相關[12-13]?！叭幮浴比橄侔┗颊適iRNA-373表達量明顯高于雌激素受體陽性的Luminal型乳腺癌患者[13]。此外，還有研究結果表明，miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141參與了乳腺癌腦轉移，與乳腺癌的復發相關，因此可將外周血miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141作為診斷乳腺癌腦轉移與復發的潛在生物標志物[14]。由于外泌體中的lncRNA表達量相對較低，且檢測難度大，目前相關研究較少。

外泌體miRNA作為乳腺癌重要的診斷指標已被廣泛認可，但是目前檢測外泌體miRNA的方法仍存在耗時、回收效率低的問題。此外，提取miRNA時還需破壞外泌體，易造成miRNA損失并影響檢測結果的準確性。因此，目前亟需建立一種可以快速、準確地檢測外泌體內miRNA的方法。有學者制備了一種仿病毒融合囊泡，該囊泡可以通過與外泌體膜的融合將分子信標主動遞送到外泌體內部，從而實現外泌體內特異miRNA的準確、快速、原位檢測；在此基礎上，他們又進一步開發了一類高效、多指標檢測的膜融合囊泡，通過融合蛋白和多肽的篩選，提高囊泡的融合效率；通過多種核酸分子信標的同時包載，實現多種腫瘤特異外泌體miRNA的同步檢測，獲得更豐富的腫瘤診斷信息[15]。

3 外泌體在乳腺癌治療中的作用

侵襲、轉移和耐藥是腫瘤治療失敗的主要原因。外泌體作為細胞間核酸及蛋白質等物質傳遞的主要方式，在促進腫瘤細胞耐藥、侵襲、轉移中發揮了關鍵作用[16-17]。外泌體除了作為液體活檢的目標待測物用于乳腺癌的診斷外，在乳腺癌治療上也發揮著日益重要的作用，包括調控外泌體的表達、將外泌體作為藥物運輸載體、將外泌體進行工程化修飾用于靶向治療等。

3.1 通過調控外泌體的表達來治療乳腺癌

近年來，學者們發現有多種藥物可通過抑制外泌體的表達來發揮抗腫瘤作用，如抗菌藥物磺胺異噁唑可通過降低外泌體分泌的內皮素受體A的表達來抑制乳腺癌外泌體的產生，在乳腺癌移植瘤模型中顯示出抗腫瘤和抗轉移作用[18]；鹵夫酮可顯著降低乳腺癌細胞外泌體的釋放，減少miRNA-31的傳遞，進而抑制乳腺癌細胞的增殖[19]；紫草素能夠顯著抑制乳腺癌細胞外泌體的分泌，從而改變腫瘤微環境，并抑制乳腺癌細胞進一步增殖[20]。盡管通過調控腫瘤細胞來源的外泌體用于乳腺癌治療這一想法在很久之前就已經出現，但實際進展并不理想。

3.2 將外泌體作為藥物運輸載體治療乳腺癌

常規化療藥物（紫杉醇、他莫昔芬、常春新堿等）由于具有較強的細胞毒性及較弱的組織選擇能力，在用于乳腺癌治療時常會產生嚴重的毒副作用。細胞來源的外泌體除具有良好的生物兼容性外，還具備強大的生物運載能力。因此，外泌體正逐步成為乳腺癌化療藥物遞送的載體。目前，外泌體藥物裝載的主要方式有轉染試劑法[21]、超聲法[22]、凍融循環法[23]、電穿孔法[24]等。MILANO等[25]的研究結果顯示，在大鼠模型中，間充質祖細胞來源的外泌體包載的多柔比星/曲妥珠單抗能夠顯著改善其心臟毒性，并增強對乳腺癌細胞的細胞毒作用。KALIMUTHU等[26]利用間充質干細胞來源的外泌體包載紫杉醇，顯示出更好的體內外抗腫瘤效果。

外泌體除作為化療藥物理想的載體外，對小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及miRNA等人工合成的核酸類物質也有非常好的傳遞作用。LIMONI等[27]通過特異性改造，將siRNA裝載于HEK293細胞來源的外泌體中，改造后的外泌體顯示出顯著的HER-2靶向性，并成功敲低乳腺癌細胞TPD52基因的表達。ALVAREZ-ERVITI等[28]通過電穿孔法將siRNA裝載至樹突狀細胞來源的外泌體中，可有效降低小鼠腦細胞中BACE1基因的表達。LIANG等[29]將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶和miRNA-21寡核苷酸拮抗片段一同包裹在外泌體中，成功實現了HER-2陽性腫瘤細胞的靶向治療。

3.3 通過外泌體的工程化修飾來進行乳腺癌的靶向治療

相對于直接裝載治療藥物的外泌體而言，工程化的外泌體修飾因方式多樣、生物學功能眾多而更加受青睞。外泌體表面定向性修飾是增強外泌體靶向性的一種有效方式。YU等[30]通過修飾改造，將化療藥物Erastin成功裝載于葉酸標記的外泌體中，實現了乳腺癌的靶向治療。XIONG等[31]通過計算機建模，設計并采用巨噬細胞制備了一種NPs/Rex外泌體，該工程化外泌體在體內顯示出更長的血液循環半衰期、更強的靶向性、更好的生物相容性，對原位乳腺癌肺轉移病灶具有更好的靶向化療作用。LI等[32]通過對巨噬細胞來源的外泌體做c-Met修飾，成功實現了外泌體攜帶多西他濱對乳腺癌的靶向治療。

通過制備工程化修飾的外泌體用以激活機體免疫，從而實現腫瘤的免疫治療是外泌體工程化修飾用于腫瘤治療的另一種有效方式。有學者利用外泌體錨定肽CP05將高遷移率族核小體結合域蛋白1（high mobility group nucleosome binding domain protein 1，HMGN1）的功能短肽N1ND負載于不同腫瘤細胞來源的外泌體表面，修飾后的外泌體在被運輸到樹突狀細胞中后，成功活化機體免疫功能，實現了中晚期肝癌、胰腺癌和乳腺癌的免疫治療[33-34]。SHI等[35]通過修飾改造，在外泌體的表面同時表達T細胞CD3抗體和HER-2抗體，借助2個抗體的作用將HER-2陽性的乳腺癌細胞呈遞給CD3+T細胞，從而實現乳腺癌的免疫治療。

4 小結與展望

在過去的幾十年中，隨著外泌體相關研究的不斷深入，人們對外泌體有了更全面的認識，同時不斷探索基于外泌體的乳腺癌診療方式。當前，制約外泌體用于腫瘤診療的因素主要有以下3點：（1）外泌體的提取、鑒定方式并不統一。相對于品種繁多的商品化提取試劑，傳統的超速離心法更具權威性，但也是最繁瑣、要求最高的分離方式；外泌體的鑒定除電子顯微鏡外，并不能進行有效的定量分析。因此，建立行之有效的、統一的外泌體分離及鑒定方法顯得尤為緊迫。（2）外泌體的基礎生物學知識仍需要進一步深入探索，如外泌體在體內分布的行為方式，只有明確了這一點，才能有效避免外泌體藥物在肝臟中的富集和清除。（3）更為有效、精準的外泌體改造方式仍需進一步研究。

雖然到目前為止還沒有一種基于外泌體的抗腫瘤藥物獲批上市，但得益于外泌體的天然屬性及其強大的物質運載能力，外泌體依然有成為腫瘤靶向藥物的巨大潛力。外泌體的工程化修飾用于腫瘤的靶向治療及免疫治療，將是未來外泌體抗腫瘤藥物研發的關鍵所在。