食品中丙烯酰胺檢測方法研究進展

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(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院,湖北武漢 430020)

丙烯酰胺(Acrylamid,AA)是一種白色晶體物質,室溫下穩定,作為重要的化工原料在熔融或暴露在紫外光以及氧化條件下易發生聚合反應產生聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺具有較好的穩定、絮凝作用,在污水處理、石油開采、造紙工業等行業都有十分廣泛的應用,素有“百業助劑”之稱[1-2]。AA于1994年被國際癌癥研究機構劃分為“2A類可能致癌物”[3]。2002年瑞典研究人員發現富含碳水化合物低蛋白質的植物性食物在油炸及焙烤等高溫(>120 ℃)烹飪處理下容易產生AA[4-5]。在特定條件下,羰基化合物(還原糖)和氨基化合物(蛋白質、氨基酸)發生非酶褐變的美拉德反應過程中也會產生AA[6-7]。食品中AA的產生引起了國際社會和各國政府的高度關注。大量研究表明,AA具有生殖毒性[8]、遺傳毒性[9]和致癌性[10]。世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)聯合食品添加劑專家委員會(JECFA)對食品中AA的危害進行了系統評估,警示其對人類健康存在潛在性危害,根據各國居民AA攝入量,將人均攝入量控制為0.001 mg/(kg·d)[11]。

食品中AA的形成是一個多級反應過程,目前多數學者認為美拉德反應中天冬酰胺和還原糖是形成AA的關鍵因素[12]。美拉德反應賦予了食品特定的色、香、味,是提升食用品質的重要途徑,富含碳水化合物的食品在熱處理過程中不可避免會產生AA。國內外學者發現調整加工工藝,例如溫水或檸檬酸溶液浸泡原料能降低油炸薯條中的AA含量[13]。降低加工溫度和減少加熱時間也可減少AA生成量[14]。在加工過程中,添加抑制劑,例如天冬酰胺酶[15]、NaCl[16]、氨基酸[17]、黃酮類物質[18],能明顯抑制食物中AA含量。人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸AA,但目前還未有飲食中暴露評估和流行病學調查研究表明AA與人類健康存在直接關系。

鑒于AA的毒性以及在食品中存在的普遍性,為了保護消費者安全,準確分析食品中AA含量,降低食品安全風險顯得尤為重要。隨著科技的發展,尤其是新型納米材料的發展,目前已有大量AA新型檢測方法被報道[19-20],本文對國內外用于食品中AA的傳統和新型檢測方法進行總結和分析,分析其優缺點,針對當前準確、快速的檢測需求,為開發良好選擇性、高靈敏度、抗干擾能力強的準確、快速檢測方法提供新的思路。

1 食品中丙烯酰胺的前處理方法

食品中的AA分子量低、極性高、水溶性好,且缺乏明顯的發色團(芳香環、共軛雙鍵、三鍵)等性質,很難直接定量檢測,需要對食品樣品進行前處理。包括物理方式,如粉碎、研磨、均質、玻璃棉過濾、離心、高速離心和超濾等,其可除去一些大顆粒物質、淀粉基質和非極性的大分子物質;化學方式,如石油醚等非極性溶劑的液-液萃取除油脂,Carrez試劑(鐵氰化鉀/硫酸鋅)、甲醇等除去蛋白質等。AA為極性小分子化合物,水溶性好,一般采用極性強的溶劑作為提取劑,如水、鹽溶液、有機溶劑(甲酸、丙酮、乙腈等)。大多數食品樣品中的AA在水中能夠被完全提取,因此水是使用最廣泛的提取劑,可最大程度地去除食品中非極性物質的干擾。然而,用水做提取劑時,食品基質中的其他極性物質也會保留于提取液中,因此需在后續的步驟中將這些極性干擾物除去。相較于水來說,有機溶劑提取體系可將包埋在脂肪微粒中的AA充分提取出來,尤其適用于高脂食品,且溶劑易蒸發便于濃縮。研究報道顯示,將水(或鹽溶液)與有機溶劑混合可有效提高AA的提取效率[21]。

除去AA提取液中的干擾物,通常采用固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)技術來純化提取液。該方法簡單、穩定、準確、可重復性好,已被廣泛應用于醫藥衛生、分析化學等領域。根據填料保留機理的不同,SPME柱可分成兩類。第一類是填料保留AA,SPME柱內的填料通過氫鍵、π-π作用、陽離子交換作用將AA保留在SPME柱上,再用極性溶劑洗脫并收集,如Oasis HLB和Bond Elut-Accucat柱等[22]。針對AA開發出特異性吸附材料作為填料能提高吸附效率,如Arabi等[23]合成仿生分子印跡功能化二氧化硅納米材料作為分散劑,其回收率達91%,而無印跡二氧化硅納米填料萃取回收率為39%～60%。另一類是填料保留雜質從而到純化的目的,如C18柱等[24]。經過純化后的提取液進行后續檢測,在靈敏度和準確性上將大幅提高。

2 丙烯酰胺的傳統檢測方法

目前用于食品中AA的標準/傳統檢測方法主要有氣相色譜-串聯質譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS),高效液相色譜-質譜/質譜聯用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)和毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)。

2.1 氣相色譜-質譜法(GC-MS)

運用GC-MS檢測AA已被廣泛認可,國家衛生和計劃生育委員會頒布《GB 5009.204-2014食品中丙烯酰胺的測定 穩定性同位素稀釋的氣相色譜-質譜法》作為檢測AA的第二法[25],學者對于GC-MS檢測AA也有大量研究[26-27]。GC-MS法要求被分析物必須具有一定的熱穩定性和揮發性,但AA屬熱不穩定性的化合物,遇熱易分解,不能直接用于檢測,一般先通過衍生化處理以提高穩定性,進而提高檢測的準確度和靈敏度。溴化衍生是常用的衍生方法,AA溴化衍生產物主要有2,3-二溴丙酰胺或2-溴AA,測定2,3-二溴丙酰胺應用最為廣泛[28]。常用溴化試劑有兩類,一種采用飽和溴水和溴化氫作為衍生化試劑[29],此種衍生方法不僅需要較長時間,而且飽和溴水較難制備,操作相對危險;另一種采用溴化鉀與溴酸鉀反應生成的新生態溴參與衍生化反應,在安全性方面提高很多,所需衍生時間相對較短,我國國標中推薦使用這種衍生方法[30]。

采用GC-MS檢測AA時一般采用穩定性同位素稀釋技術,在試樣中加入13C3標記的AA作為內標物,進行多反應離子監測或選擇離子監測定量。羅蘭等[31]利用d3-AA作內標,用占噸醇做衍生試劑,建立測定不同種類熱加工食品中AA的GC-MS法。該方法檢出限為0.7 μg/kg(S/N=3),線性范圍為0.005～4 μg/mL,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)小于6.1%,回收率為95%～112%。程劼等[32]建立氣相色譜-串聯四極桿質譜(GC-MS/MS)檢測餐廚廢棄物中的AA。樣品經去離子水提取結合C18-SPEM柱凈化或者經甲酸溶液提取/Carrez試劑預處理,MCX柱凈化的兩種前處理方法進行前處理,結果該方法在3.0～30 ng/L濃度中呈現良好的線性關系,檢測限(limit of detection,LOD)為1.0 ng/g(S/N=3),回收率為95.3%～108.1%,RSD均小于4.3%。該方法穩定、靈敏度高,可用于餐廚廢棄物中AA的測定。采用GC-MS方法靈敏度高,專一性好,檢測限低,但溴化衍生所需時間較長,反應條件也較為苛刻[27]。不經衍生AA的GC-MS測定方法通常需要高靈敏氣相色譜檢測器如高分辨率飛行時間質譜、氮磷檢測器、串級質譜等,這類檢測器具有高選擇性和高靈敏度的特點,但存在檢測費用昂貴的不足。

2.2 高效液相色譜-質譜/質譜聯用法(HPLC-MS/MS)

采用液相色譜方法在樣品預處理后無需對AA進行衍生,可直接測定,簡化了分析過程,應用更為廣泛。AA經過LC分離后,進入檢測器,最常使用的檢測方法是串聯質譜儀,較少使用紫外光(ultra violet,UV)或者單獨使用MS(一級色譜的單離子監控模式,SIM)[33]。郝亞楠等[34]將樣品液反相C18萃取柱純化后利用紫外分光光度法快速測定油炸食品中AA的含量,線性范圍為0.25～6.0 μg/L,回收率為90.07%～104.8%,RSD為0.5%。UV檢測器一般在200 nm左右,檢測AA不飽和羰基的紫外吸收,UV檢測缺乏選擇性,復雜食品基質干擾檢測結果導致靈敏度不高,線性范圍在mg/L范圍內[33]。更多的研究是使用串聯質譜MS/MS的SRM或MRM模式進行檢測[35-36]。我國《GB 5009.204-2014食品中丙烯酰胺的測定 穩定性同位素稀釋的液相色譜-質譜/質譜法》推薦使用該模式作為檢測AA的第一法。HPLC-MS/MS是檢測AA可靠手段之一。王浩等[37]建立了HPLC-MS/MS測定嬰幼兒營養米粉中AA殘留的檢測方法,以MGⅢ-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離,流動相為甲醇和水(梯度洗脫),流速0.20 mL/min,同位素內標定量,LOD為10 μg/kg,回收率為90.2%～103.1%,RSD為3.80%～4.87%。該方法前處理簡單,靈敏度高,適合于嬰幼兒營養米粉中AA殘留快速檢測。Wang等[38]利用HPLC-ESI-MS/MS檢測嬰兒配方奶粉中AA,線性范圍為1～200 ng/mL,LOD為4.0 μg/kg,方法回收率為90%～110%,RSD<6.20%。Faraji等[39]利用超聲輔助液-液萃取AA后用2-萘硫醇衍生,利用HPLC檢測面包和餅干中的AA,線性范圍為10～1000 μg/L,LOD為3 μg/L,RSD為2.3%～8.2%,回收率90%～96%。相比之下,超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)常使用反相色譜柱BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),兩者的分離原理相同,UPLC管路和色譜柱較HPLC更細,柱效更高,分離效果更好,靈敏度更高。李月歡等[40]建立超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜聯用(UPLC-MS/MS)技術檢測薯片、方便面、米線中AA的方法,線性范圍為1.4～200 μg/L,加標回收率為80%～115%,RSD為1.6%～2.9%。Galuch等[36]利用UPLC-MS/MS檢測滴濾咖啡中AA,線性范圍為3～100 μg/L,LOD為0.9 μg/L,加標回收率為97%～106%,RSD為3%～9%。UPLC方法準確、靈敏,適用于食品中痕量、超痕量AA的檢測。

2.3 毛細管電泳法(CE)

CE是以熔融石英毛細管為分離通道,其內壁作為分離載體,以高壓直流電場產生的電滲流做為驅動力,基于雙電層的電泳和電滲,各組分由于電泳、電滲以及分子擴散等作用,在流動相與固定相之間沿管軸方向運動的速度差異進行分離,即利用差速運動進行分離。一般先利用CE進行高效分離,然后進入檢測器進行檢測[41]。由于AA不帶電,要實現CE法高效分析需要先使其帶上電荷,如采用表面活性劑包裹,衍生連接上易電離的物質。殷斌等[42]利用C18及弗羅里硅土混合作為萃取劑,丙酮-二氯甲烷作為洗脫劑,用基質固相分散萃取-毛細管電泳對樣品提取、凈化、富集,用二極管陣列檢測器檢測米制品中AA,該方法的線性范圍為10～200 μg/mL,LOD為0.62 μg/mL,回收率為85.7%～96.4%,RSD為1.5%。Yang等[43]利用半胱氨酸通過巰基雙鍵點擊衍生AA,CE分離后結合電容耦合非接觸電導檢測馬鈴薯制品中的AA,線性范圍為7～200 μmol/L,LOD為0.16 μmol/L。此外,還有結合超聲波輔助離子液體富集AA從而提高CE分離效率[44],利用量子點調制提高CE中激光誘導熒光檢測器靈敏度[45]。CE法檢測食品中AA主要優點是快速、進樣量小、設備相對簡單,不需要復雜的前處理,同時能實現高靈敏檢測。

3 丙烯酰胺的新型檢測方法

3.1 酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)

酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是利用抗原和抗體高特異性結合的免疫學反應與酶催化反應相結合,對分析物進行快速定量檢測。而丙烯酰胺屬于半抗原小分子,不具有抗原決定簇,無免疫原性,因此其必須與大分子的免疫載體蛋白連接獲得耦合物完全抗原,通過復合物刺激動物機體后產生抗體[46]。ELISA一般有直接競爭和間接競爭兩種方法:直接競爭法是將AA抗體固定在基板上,樣品中的AA和AA-酶復合物競爭與抗體結合;間接競爭法是將AA-載體蛋白固定在基板上,基板上和樣品中的AA與抗體競爭結合,然后標記酶的第二抗體與吸附在基板上的抗體結合。隨后加入酶催化底物,產生顏色反應,檢測吸光度,結合標準曲線測定AA濃度。

付云潔等[47]用戊二醛交聯AA-牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BAS)合成免疫抗原,注入兔體內以產生抗AA多克隆抗體,采用間接競爭ELISA法檢測土豆泥中AA。在優化條件下,間接ELISA法的線性檢測范圍為50～1280 μg/L,LOD為50 μg/L,回收率為92.6%～95.5%。為了提高AA抗體的靈敏度,采用N-丙烯酸琥珀酰亞胺酯(N-acryloxysuccinimide,NAS)[48]和3-巰基苯甲酸衍生AA[49]作為半抗原來合成具有高結合常數的完全抗原。例如Quan等[50]利用NAS-血藍蛋白復合物產生抗體,采用直接ELISA結合增強化學發光方法檢測食品樣品中的AA,魯米諾-H2O2-辣根過氧化物酶的化學發光系統比傳統的3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺-H2O2-辣根過氧化物酶的可見光比色系統在靈敏度方面提升2～3個數量級,線性檢測范圍為26.3～221.1 ng/mL,LOD為18.6 ng/mL,回收率為74.4%～98.1%。Singh等[51]利用3-巰基苯甲酸-AA-BSA復合物產生抗體,采用間接競爭ELISA檢測食品中的AA,LOD為5.0 ng/g,回收率為95%～100%,與傳統LC-MS/MS檢測結果在統計學意義(P=0.15)上相似,可用于食品基質中AA的篩選和半定量檢測。相比于傳統檢測方法,ELISA方法有可比擬的靈敏度、成本低、簡單、快速,不需要昂貴的設備和復雜的樣品準備。目前,ELISA試劑盒已有大量商業化產品[52],具有較高的回收率,有望作為現場快速檢測方法,檢測結果有直接參考價值;然而,如何獲得特異性強、親合力高、穩定好的抗體是該方法需要解決的問題。

3.2 生物傳感方法

隨著技術的進步,很多新型的生物傳感方法被開發用于檢測AA。生物傳感器具有專一性好、特異性強、檢測速度快、靈敏度高、成本低、操作簡單、易實現自動分析等優點,廣泛用于食品、環境、臨床的分析和檢測中[53]。生物傳感器是一種以生物敏感材料為識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質)結合適當的理化換能器及信號放大裝置的分析工具或系統。其基本原理為:當目標物與識別元件特異性結合后,可通過信號轉換器將檢測信號轉變為電信號,經過儀表放大和輸出從而達到檢測目標物的目的。目前在AA檢測中使用較多的有電化學生物傳感器和熒光傳感器。

3.2.1 電化學生物傳感器 電化學生物傳感器檢測AA大多數采用血紅蛋白(hemoglobin,Hb)作為識別元件,AA與Hb中N-端纈氨酸的α-NH2之間相互作用,結合伏安法構建電化學傳感器?；驹硎菍b固定在電極表面,AA與Hb發生Michael親核加成反應生成聚合物,增大Hb內氧化還原對(Hb-Fe(Ⅲ)/Hb-Fe(Ⅱ))與電極之間的距離,阻礙電子傳遞,引起電極鈍化,AA濃度不同,鈍化程度也不同,可以快速測定AA含量[54-55]。提高Hb在電極上的固定效率(包括固定量和Hb的活性)和電子轉移效率是構建電化學生物傳感器檢測AA的關鍵。由于Hb的氧化還原中心位于絕緣的肽鏈中,將Hb直接修飾于電極上會抑制其活性。因此,通常用納米材料(碳納米管、石墨烯、納米金等)來增加Hb的固定效率和電子的轉移效率[56-58]。Krajewska等[59]用Hb/單臂碳納米管修飾的玻碳電極檢測薯片提取液中的AA,該方法的線性范圍7.1×10-4～7.1×10-2μg/kg,LOD為0.071 μg/kg。Garabagiu等[60]用Hb-納米金修飾氧化銦錫玻璃電極檢測食品中的AA,線性檢測范圍為0.71～7.1×102μg/kg,LOD為2.84 μg/kg。Asnaashari等[61]將單鏈SH-ssDNA1通過金-S鍵修飾絲網印刷金電極表面,Hb修飾的互補ssDNA2與ssDNA1配對,將Hb固定在金電極上,采用方波伏安法檢測薯條水提取液中的AA。該方法的線性范圍為2.0×10-6～5.0×10-2mol/L,LOD為1.58×10-7mol/L,具有良好的重現性和穩定性。景俊賢等[62]采用介孔材料/金納米粒子/血紅蛋白(CMK-Au-Hb)修飾電極,對AA實現快速檢測。采用試劑分散和滴涂技術制備介孔材料敏感膜并修飾在電極上,同時采用循環伏安法和電化學交流阻抗法研究AA在所制備傳感器上的電化學行為,發現AA濃度在1.0×10-11～1.0×10-4mol/L范圍內,峰電流與濃度的負對數呈良好的線性關系,LOD為3.3×10-12mol/L。

除了利用Hb-AA反應設計電化學傳感器方法以外,Kleefisch等[63]采用石英晶體微天平方法來測量AA,首先利用四個大環分子四內酰胺合成超分子,超分子內部的空穴位點對AA具有親和性,可特異性識別AA。將此超分子作為識別元件固定于石英晶體芯片上,AA結合到芯片上會引起共振頻率變化,從而產生響應信號。以此原理構建的壓電傳感器的LOD為10 ng/kg,同時具有良好的特異性,但僅適用于有限種類食品中AA的檢測,對于不同來源AA的交互性待進一步驗證。分子印跡技術是一種分子識別技術,合成的印記模板可作為識別元件用于開發食品分析檢測方法[64]。例如,毛祿剛等[65]將AA溶膠凝膠分子印跡膜沉積在多壁碳納米管-殼聚糖修飾的電極表面構建電化學傳感器檢測AA,該方法的線性范圍為0.2～10 μg/mL,LOD為0.079 μg/mL。該方法簡便,準確,但構建的傳感器使用時間相對較短,在4 ℃下傳感器有效期只有9 d,需要進一步優化。還有直接利用AA電化學特性進行直接檢測,Zargar等[66]將鈷離子加入AA溶液中,在方波伏安法下產生催化峰電流,電流信號正比于AA濃度,該方法的線性范圍為200～800 ng/mL,LOD為3.52 ng/mL。該方法簡單、快速,但在高濃度的堿土金屬例子溶液中,尤其是Na+存在時不靈敏,Na+在食品中廣泛存在,這限制了該方法的使用。

電化學生物傳感檢測AA不需要復雜的樣品前處理,Hb-AA反應的特異性、氧化還原電位高靈敏度以及基質成分引起的干擾低,使得基于此原理的電化學生物傳感器可應用于檢測薯片中的AA。具有良好生物相容性的納米材料不僅可以增加電極上Hb的固定量且保持Hb的生物活性,從而提高電化學生物傳感器的靈敏度。然而,Hb和AA之間不可逆的相互作用導致工作電極很難重復使用,在今后的研究中,需要開發可重復使用的修飾方法,并在不同食品樣品中驗證方法的通用性,有望替代傳統的HPLC-MS、GC-MS。

3.2.2 熒光傳感器法 熒光檢測法因其快速、高靈敏度應用于食品樣品中AA的檢測[67]。Liu等[68]利用AA通過霍夫曼反應降解生成乙烯胺,乙烯胺再與熒光物質反應生成吡咯啉酮,吡咯啉酮在480 nm波長下發射強熒光,隨著AA的濃度增加,熒光強度增強。用此方法構建熒光傳感器測定食品中AA的含量,線性范圍為0.05～20 μg/mL,LOD為0.015 μg/mL。該方法簡單、快速,但只能檢測能發射紫外光的物質。Hu等[69]將類AA物質修飾在量子點(quantum dot,QDs)表面,功能化QDs表面的碳碳雙鍵在紫外光和光引發劑的共同作用下發生光聚合反應,引起QDs間距縮小,導致熒光強度減弱。當AA存在時,AA與QDs表面的雙鍵均參與光聚合反應,使得間距QDs增大,熒光強度增強。該方法對AA的線性檢測范圍為0.5～5.0×104μmol/L,LOD為0.5 μmol/L。但L-天冬酰胺(生成AA的前體物)對該方法存在嚴重干擾,檢測食品樣品時,需要加入L-天冬酰胺酶降解,以降低L-天冬酰胺的干擾。Liu等[70]利用分析印記技術將Mn2+摻雜ZnS QDs固定在氧化石墨烯表面,洗去AA后形成AA印跡模板,ZnS QDs作為熒光源。當AA存在,AA與嵌入印跡模板中淬滅ZnS QDs的熒光,根據熒光淬滅強度檢測樣品中的AA,該方法的線性范圍為0.5～60 μmol/L,LOD為0.17 μmol/L,水樣品中加標回收率為100.2%～104.5%,RSD為1.9%～3.9%。Asnaashari等[71]利用納米金和FAM標記的單鏈DNA構建簡單熒光傳感器,AA存在時,AA與互補DNA相互作用形成加成物,FAM標記的單鏈DNA游離在溶液中從而吸附在納米金表面,FAM的熒光被納米金淬滅。該方法的線性范圍為1×10-7～0.05 mol/L,LOD為1×10-8mol/L。以上開發的熒光傳感法簡單快速,但存在明顯的缺陷,如針對AA中不飽和雙鍵特異性差、AA與DNA相互作用力弱,容易受到食品基質干擾的缺點,在檢測實際樣品中需要結合高效的AA分離富集方法,以除去雜質干擾,來保證檢測結果準確度。

3.3 光譜法

對于AA的檢測常用分子光譜法中除了紫外-可見分光光度法之外,還有比色法、拉曼光譜、紅外光譜法等。

比色法具有快速、簡便、直接觀察顏色結果的優點,廣泛應用于食品檢測。Hu等[72]利用石英晶體微天平篩選出對AA特異性識別的適配體作為識別元件,AA存在時,適配體與AA結合,溶液中納米金加入高濃度鹽溶液,引起納米金聚集,顏色由紅變藍,不存在AA時,適配體吸附在納米金表面,加入高濃度鹽溶液后紅色納米金顏色不變。該方法的檢測線性范圍為0.5～10 μmol/L,LOD為0.390 μmol/L。Hu等[73]還利用親核試劑引發的硫醇-烯-邁克爾加成法構建了納米金比色傳感器檢測AA,AA存在時,與谷胱甘肽上的巰基發生邁克爾加成生成谷胱甘肽-AA復合物,由于巰基被消耗,加入納米金后顏色不變;不存在AA時,谷胱甘肽上的巰基與納米金反應,使得納米金聚集,顏色由紅變藍。此方法有較高的靈敏度,線性范圍為0.1～80 μmol/L,LOD為28.6 nmol/L。與HPLC法相比,該法具有簡便、快速、準確、樣品預處理簡單、無需衍生化等優點。

基于表面拉曼散射增強傳感器(surface enhanced raman scattering,SERS),具有分子特異性、高分辨率、高靈敏度等獨特優勢,其原理是用通常的拉曼光譜法測定吸附在膠質金屬顆粒(如金、銀或銅)表面的樣品,或直接吸附在金屬片粗糙表面的樣品,拉曼光譜信號受表面等離子共振從而得到增強。Gezer等[74]用此方法實現了食品中AA的檢測,其拉曼光譜特征峰在1447 cm-1處,線性范圍為10 μg/mL～10 ng/mL,LOD為10 μg/mL。Cheng等[75]結合分散固相微萃取和拉曼光譜,在還原石墨烯上沉積納米金顆粒進行拉曼光譜信號增強,所構建的方法線性范圍為5～100 μg/kg,LOD為2 μg/kg。拉曼光譜檢測快速、簡單,但是極少數貴金屬粗糙面才具有強SERS效應,其制作工藝難以統一標準化導致其重復性較差,應用受到限制。

Ayvaz等[76]應用便攜式手持紅外光譜儀對薯片進行了快速篩選和AA含量的測定,在206～510 μg/L范圍內建立偏最小二乘回歸模型,預測相關系數達到0.91,預測誤差在22.1～28.9 μg/L內,可用于高通量AA的快速檢測。近紅外光譜法分析簡便快速、不會破壞待分析樣品,可用于AA在線檢測。此外,趙琛[77]對油炸食品中的AA經提取后,利用魯米諾-過氧化氫化學發光體系的增強作用,建立了AA的流動注射化學發光新的分析方法。該法簡便快捷、成本低廉、實用性強,適用于測定油炸食品中的AA。

3.4 機器視覺方法

美拉德反應中還原糖和天冬酰胺反應生成AA,常伴隨著顏色的變化。G?kmen[78]課題組早期采用L*a*b體系來測定食品的顏色對AA進行定量。隨后采用機器視覺法將食品樣品圖像進行顏色分區,用多種算法對圖像進行分析處理,建立褐變比率與AA濃度之間的關系來定量分析食品中AA的含量[79]。王成琳[80]探討了計算機視覺技術檢測熏烤肉中AA含量,發現熏烤肉中AA含量值與烤肉圖像兩個表面的a*分量的平均值有很強的相關性,相關系數達0.971,與國標方法相比,最大相對誤差為5.04%?；谑称奉伾肿兊臋z測方法快速、簡單、易操作、且無需樣品前處理步驟,機器視覺方法可以實現實時在線監測食品加工過程中AA的含量,但這種基于褐變的檢測方法不夠準確,受物料、加工方式等因素影響,適合于AA的初步篩查。

4 結論與展望

目前國際上已研究開發了多種AA的檢測方法,傳統的氣相色譜、液相色譜及與質譜聯用技術是當今國際常用來檢測AA含量的標準方法,這些方法選擇性好、結果可靠,但是往往需要較昂貴的儀器及專業操作,且樣品前處理通常比較復雜,檢測費用高,因此難以進行大范圍的樣品監測。

隨著消費者對食品健康消費需求越來越高,各國對食品中AA的安全性越來越重視,越來越多的快速檢測方法被開發出來。這些方法具有簡便、靈敏、準確、成本低的優點,具有很大應用潛力,為準確、快速檢測AA提供了更多的選擇。于此同時,為保證食品快速檢測方法評價工作科學合理、標準統一,2017年國家食品藥品監管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價技術規范》,為開發AA快速檢測方法提供的標準和依據,表明快速檢測方法已經成為可選擇檢測方法之一。通過本文綜述發現,在這些快速檢測方法中,免疫檢測技術在微量及痕量、準確、快速檢測方面具有很大優勢,具有良好的應用前景。如何獲得特異性好、靈敏度高、穩定性好的抗體是目前急需解決的問題,因此目前尚未能進行實際應用。生物傳感技術基本不受食品體系中其他成分的干擾,具有高靈敏度和選擇性,在分析食品中AA的研究表現出巨大的發展潛力,但在傳感器的穩定性和重復性需要進一步優化。光譜法能實現AA含量的現場快速檢測,其中近紅外光譜和機器視覺方法可用于AA的在線快速篩查,具有很強的應用潛力。不同的檢測分析方法各有其利弊,需要根據食品樣品特點和應用需求合適選擇分析檢測方法。其次樣品的前處理,分析物的分離與富集仍然需開發簡便、高效的方法,其中自動化和微量化是今后發展趨勢。結合新技術和新材料的發展,開發的AA新型檢測技術應往簡單、快速、成本低、靈敏度高、操作簡單、現場分析等方面發展。