miR-144/451在呼吸系統疾病中的研究進展

顏月，李桃，方蕾

(揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225009)

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長度為20～25個堿基的單鏈小分子非編碼RNA，它通過與靶基因信使RNA堿基配對，引導沉默復合體降解信使RNA或阻斷其翻譯，從而實現對靶基因表達的調控[1]。miRNA作為一類新型的基因調控分子，在細胞增殖、分化、發育、凋亡等多種生理過程以及許多疾病(包括呼吸系統疾病)的病理過程中發揮著至關重要的作用。隨著miRNAs基因測序、芯片技術以及生物信息學對miRNAs基因及靶基因預測，越來越多的候選miRNAs可能成為臨床疾病特異性治療靶標，某些miRNA靶向藥物(治療腫瘤的miR-34擬似物，治療肝炎的miR-122拮抗劑)也已經進入臨床藥物研發階段[2]，miRNAs研究和應用的前景十分廣闊。miR-144和miR-451是一個雙順反子miRNA基因位點。miR-451于2005年從人腦垂體RNA中提取并命名，定位于人類基因組中17q11.2；miR-144位于斑馬魚第5號染色體，miR-144/451基因簇有相同的轉錄調控啟動子[3]。miR-451是成熟紅細胞中表達量最高的miRNA，在紅細胞正常分化過程中，表達量逐漸增加，而miR-451的缺失則會引起紅細胞發育障礙[4]。在肺的炎癥性疾病和肺腫瘤等肺組織損傷和修復過程中，miR-144/451出現異常表達，并通過影響特定靶基因的表達進行調控，可能成為疾病的生物學標志物?，F就miR-144/451在呼吸系統疾病中的研究進展予以綜述。

1 miR-144/451概述

miR-144/451定位于人類基因組第17號和第11號染色體，相隔93 bp成簇存在，兩者在進化過程中高度保守。miR-144/451是紅系分化發育的重要調節因子，在紅細胞中高表達，參與多種血液病的發生、發展。miR-451對氧化應激造成的紅細胞損傷具有保護作用，miR-144/451剔除小鼠表現為晚幼紅細胞成熟減少，小鼠的有核紅細胞中，蛋白14-3-3 zeta積累，導致轉錄因子叉頭框蛋白家族O亞型-3從細胞核轉移至細胞質，抑制抗氧化基因過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶的轉錄，使得紅細胞易受氧化劑的破壞[5]。而在急性失血和溶血性貧血這類紅細胞需求急劇增加的病理狀態下，miR-144/451則成為紅細胞的關鍵保護因子，可通過抑制鈣結合蛋白-39調控的AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白效應通路來提高紅細胞的存活率，進而促進急性貧血的恢復[6]。在β珠蛋白合成障礙性貧血的實驗研究中，李瑤瑤[3]發現，miR-144/451參與調控了β珠蛋白合成障礙性貧血的發病過程，而當miR-144/451表達缺失時，貧血狀況則顯著改善；該研究分析指出，是miR-144/451激活了靶基因α血紅蛋白穩定蛋白，而高表達的α血紅蛋白穩定蛋白可結合較多的α珠蛋白，減少了α珠蛋白在紅細胞膜上的沉淀，從而改善了對紅細胞的破壞。而miR-144在鐮刀狀貧血患者紅細胞中呈現高表達，抑制靶向蛋白核因子E2相關因子的表達，引起核因子E2相關因子下游的抗氧化酶超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等的表達失調，造成貧血加重[7]。近年研究發現，miR-144/451在非紅系細胞中也存在表達，并且參與腫瘤、缺血性心臟病、神經系統疾病、呼吸系統疾病等多系統疾病的發生與發展[8-10]，提示miR-144/451極有可能成為治療這些疾病的新靶點。

2 miR-144/451與肺的炎癥性疾病

常見肺的炎癥性疾病包括肺部感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺纖維化。雖然這些疾病致病因素不同，但在其病理過程中均存在不同種類、不同程度的炎癥細胞浸潤和炎癥介質分泌。慢性炎癥期哮喘和COPD患者還會出現氣管結構的改變甚至纖維化。在疾病發展過程中，肺的固有細胞或免疫細胞中miR-144/451表達的變化可能對關鍵病理環節產生影響。

2.1肺部病原微生物感染 肺臟作為與外界相通的臟器，易受病毒、細菌等多種病原微生物的侵襲。在流感病毒感染的小鼠肺上皮細胞中，miR-144表達上調，miR-144通過靶向結合腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體相關因子6信使RNA 3′非翻譯區，降低其蛋白水平，抑制了宿主抗病毒免疫TNF受體相關因子6-干擾素調節因子7通路，損害了上皮細胞的抗病毒能力，加重了感染小鼠間質性肺炎和上皮細胞壞死[11]。而在流感病毒刺激的肺樹突狀細胞中，miR-451表達上調，抑制miR-451表達，負調控因子YWHAZ/14-3-3 zeta蛋白水平升高，樹突狀細胞分泌的白細胞介素(interleukin，IL)-6、TNF、CC趨化因子配體5和CC趨化因子配體3增加[12]，即說明病毒感染可特異性地誘導miR-451發揮負調控作用，且級聯調節樹突狀細胞產生細胞因子。

miR-144在細菌內毒素脂多糖刺激的小鼠樹突狀細胞中出現顯著性下調，誘導其高表達則抑制了細胞因子分泌和信號分子p65的磷酸化，并且雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-144可能通過靶向核因子κB受體活化因子配體在Toll樣受體4(Toll-like receptor，TLR4)/核因子κB通路中發揮負向調控作用[13]。Li等[14]在脂多糖誘導小鼠肺損傷模型中發現肺組織miR-144-3p表達上調，負調控其靶基因水通道蛋白-1，參與肺上皮細胞凋亡。小鼠經脂多糖腹腔注射6 h后，檢測全血miR-451的表達，結果發現，miR-451的表達顯著上調[15]；在脂多糖刺激的巨噬細胞中miR-451靶向TLR4，抑制促炎細胞因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)的分泌，從而抑制炎癥反應，減輕炎癥損傷[16]。

Lv等[17]收集了124例結核病患者的痰液和血清樣本，經檢測發現，與健康人相比，結核病患者治療前miR-144水平顯著升高，經抗結核藥物治療后結核病患者miR-144表達下降。進一步研究顯示，miR-144在活動期結核病患者T細胞中高表達，在T細胞中轉染miR-144促進其表達后可抑制TNF-α和γ干擾素生成以及T細胞增殖，表明miR-144參與調控抗結核免疫[18]。另有研究顯示，活動期肺結核患者外周血單個核細胞中miR-144表達上調，且人單核細胞來源的巨噬細胞在感染結核分枝桿菌6 h后miR-144的表達增高了8倍；且miR-144與細胞自噬關系密切，miR-144靶向人單核細胞和巨噬細胞中的自噬激活協調因子即損傷調節自噬調控基因2 發揮作用，人單核細胞內過表達miR-144可降低損傷調節自噬調控基因2蛋白的水平，抑制自噬的誘導，加重結核分枝桿菌對肺組織的損傷[19]。

2.2miR-144/451與哮喘 通過對卵清蛋白和室內塵螨誘導的過敏性哮喘小鼠全肺，以及在培養的原代人支氣管上皮細胞的實驗和檢測中均證實了miR-144參與哮喘病程的調控；其中，在卵清蛋白誘導的小鼠哮喘模型中，發現肺組織miR-144的表達上調，且與氣道炎癥反應程度呈正相關，機制研究顯示，miR-144靶向cAMP反應元件結合蛋白1調節轉錄協同激活因子1/3，抑制轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白1的激活[20]，這一機制有助于了解哮喘早期分子的變化，更有效地防止其慢性化。由于哮喘氣道炎癥反應時一些細胞因子和炎癥介質(如IL-1β、IL-6、IL-8、選擇素E)釋放導致氣道重塑加重，研究顯示，miR-451以IκB激酶β為靶點，其高表達可抑制由IκB激酶β介導的核因子κB通路[21]；miR-451也可以靶向TLR4抑制下游炎癥因子的生成[16]。以上結果提示，miR-451可能通過抑制TLR4/核因子κB通路減緩哮喘氣道炎癥。

2.3miR-144/451與COPD和肺纖維化 Musri等[22]對12例COPD患者、9例肺功能正常吸煙者和7例非吸煙者肺動脈miRNA表達譜進行數據分析發現，與非吸煙者相比，COPD患者肺動脈的miR-451表達水平上調，并可能與調控肺血管平滑肌細胞收縮有關。Hassan等[23]發現，在體外將人支氣管上皮細胞暴露在香煙煙霧中24 h后，細胞內miR-144的表達水平顯著上調，并使得通過維持體液穩態而在肺中發揮重要作用的一種氯離子通道——囊性纖維跨膜轉導調控因子的表達被抑制，導致上皮細胞發生以慢性感染與炎癥為特征的囊性纖維化，進一步加速誘發COPD。

將經博來霉素誘導后不同時間點的小鼠肺組織表達的miRNAs與未經博來霉素誘導的小鼠肺組織表達的miRNAs進行比較發現，161個miRNAs出現差異性表達，KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫信號通路預測結果顯示，miR-144的差異性表達和凋亡與Wnt信號通路相關，導致肺泡上皮損傷引起修復反應失調[24]。大鼠霧化吸入二氧化硅誘發肺間質纖維化，肺組織miR-144表達上調[25]；靶基因預測顯示與轉化生長因子-β信號轉導途徑SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)家族SMAD4和SMAD5、金屬蛋白酶家族A解聚素和金屬蛋白酶及血小板反應蛋白基序(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)3、ADAMTS15和ADAMTS19相關[26]。Bahudhanapati等[27]研究先天性肺纖維化的患者發現，與健康志愿者相比，成纖維細胞中的miR-144-3p表達上調；在正常的肺成纖維細胞中過表達miR-144-3p則顯著降低其靶蛋白松弛素受體——松弛素/胰島素樣家族肽受體1的水平，增加纖維細胞α-平滑肌肌動蛋白表達，促進纖維化的發生。

3 miR-144/451與肺部腫瘤

肺癌的發病率和病死率位居癌癥患者首位，其機制研究和靶向治療一直是研究熱點。研究顯示，miR-144/451的表達水平與肺癌的侵襲轉移、預后以及放化療的治療效果相關；對109例肺癌患者腫瘤組織的miRNA芯片分析顯示，miR-144-3p/5p、miR-451a在肺癌患者(如肺腺癌、肺鱗癌等非小細胞性肺癌)中呈現低表達[8]。Wu等[28]通過試驗發現，肺腺癌患者組織中miR-144-3p的表達與血清IL-1β水平呈負相關，且高miR-144-3p組預后更好，體外IL-1β刺激A549細胞后miR-144表達也增高；由于IL-1β引發的炎癥也是促進病程惡性轉化、致癌的一個重要因素，提示IL-1β和miR-144-3p對于這類疾病的診斷可能是獨立危險因素，參與炎癥促進肺腺癌患者腫瘤的發展過程。Liu等[29]發現，miR-144-3p靶向zeste基因增強子同源物2抑制了肺腺癌細胞的增殖和侵襲性；而Qu等[30]在研究中發現的一種環狀RNA hsa_circ_0020123在癌組織中表達升高，與非小細胞性肺癌分化程度差、淋巴結轉移、預后差密切相關，并且可以通過與miR-144競爭性結合上調zeste基因增強子同源物2和鋅指E盒結合同源框1，表明miR-144的低表達決定了hsa_circ_0020123介導的致癌特性。在肺鱗癌中，miR-144-5p/3p在腫瘤組織中也呈現低表達，且預測了患者的不良預后，過表達則可顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；致癌靶點的分析指出，SLC44A5(solute carrier family 44 member 5)、MARCKS(myristoylated alanine rich protein kinase C substrate)和NCS1(neuronal calcium sensor 1)這3個基因可能受miR-144調控，其中NCS1表達是患者預后差的獨立因素[31]。另外，暴露于輻射的非小細胞肺癌患者癌組織中miR-144-5p的表達也下調，如果上調miR-144-5p則顯著抑制激活轉錄因子2的表達，可增加非小細胞肺癌的放射敏感性，抑制疾病進程[32]。

非小細胞肺癌組織中miR-451表達水平也顯著高于相應的非癌組織，過表達miR-451可顯著抑制A549細胞的生長，增加A549細胞對化療藥物順鉑的敏感性，誘導細胞凋亡[33]。通過對39例多西他賽化療耐藥的晚期肺腺癌患者和體外多西他賽耐藥細胞株研究發現，Notch-1負調控miR-451，繼而靶向多藥耐藥蛋白-1，介導癌細胞對多西他賽的耐藥反應，促進癌細胞增殖[34]。同樣，在多西他賽耐藥細胞株(SPC-A1/DTX和H1299/DTX)中，miR-451表達顯著下調，Chen等[35]發現，上調miR-451表達可以通過結合原癌基因c-Myc信使RNA 3′非翻譯區，阻斷下游胞外信號調節激酶/糖原合成酶激酶-3β通路，防止耐藥細胞發生上皮-間充質轉化表型改變，抑制腫瘤侵襲。miR-451在肺鱗癌患者的臨床標本中也呈現低表達，可能參與調控驅動蛋白家族成員2A，進而促進鱗癌的惡性轉化[36]。肺結節具有惡變的風險，對肺癌的早期篩查具有重要的臨床價值。以孤立性肺結節為例，Zhang等[37]對比分析了39例惡性和30例良性肺結節患者，發現miR-144在惡性肺結節患者的腫瘤組織和外周血中表達降低；機制研究發現，miR-144通過靶向鋅指E盒結合同源框1抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡，限制肺癌的遷移和擴散，故miR-144低表達對惡性肺結節甚至肺癌的診斷具有指導意義。

4 miR-144/451與其他肺部疾病

Xu等[38]采集了20例肺移植引起的免疫排斥反應——1例閉塞性細支氣管炎綜合征患者和19例未發生排斥反應的肺移植受者的活體標本進行比較，發現閉塞性細支氣管炎綜合征患者血清中的miR-144水平顯著升高，且調節轉化生長因子-β的信號通路參與了肺移植后的免疫調節。miR-144-3p在肝肺綜合征大鼠的肺組織和肺微血管內皮細胞中表達水平降低，過表達miR-144-3p通過靶向抑制酪氨酸激酶2減少內皮細胞的增殖，從而減輕肺內血管異常擴張所致的氣體交換障礙[39]。Song等[40]在野百合堿注射誘導的肺動脈高壓小鼠模型中觀察到血漿miR-451的表達顯著降低，同時miRNA芯片結果顯示，與非肺動脈高壓患者相比，肺動脈高壓患者血漿miR-451的表達也顯著降低，同時聯合使用多普勒超聲心動圖診斷則更具有臨床意義。

5 小 結

目前，miR-144/451在肺癌中的作用較為明確，普遍認為其具有抑癌作用。但是在另一大類發病率較高的肺部炎癥性疾病中miR-144/451的作用尚不明確。而且，在同一疾病中miR-144/451在肺固有組織細胞或免疫細胞中的表達水平可能呈現出不同的變化，所引起的最終效應也不同，其作用及調控機制仍需要深入探討。另外，多數研究主要在離體細胞和動物模型中開展，與臨床的相關性及是否具有組織特異性仍需明確，可以采取測定循環miRNA作為臨床相關性的有利補充。而且從目前的研究來看，較集中在miR-144/451對下游靶基因的直接調控作用，很少涉及上游分子對miR-144/451的調控作用，這可能成為新的研究思路。