NHE1、netrin-1在動脈粥樣硬化中的作用

楊卉，莫顯剛，王蘭，張詩悅

(1.貴州醫科大學，貴陽550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院綜合病房，貴陽 550004)

冠心病、腦卒中以及周圍血管性疾病是當今世界發病率、病死率最高的一組疾病。目前我國心血管病患病率及病死率處于逐年上升階段，據2017年《國家心血管病報告》及相關研究統計顯示，目前我國心血管病患者約為2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，心血管病死亡占居民總死亡原因的40%以上，居首位[1]。心血管疾病的主要病理基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)。As是血管難以消退的慢性炎癥性疾病，以單核細胞/巨噬細胞等吞噬氧化型低密度脂蛋白膽固醇等形成泡沫細胞，并持續滯留動脈壁為主要特征[2]。預計2020年，心血管疾病造成的病死率可高達36%[3]，對人類的健康生存將造成巨大影響。研究發現，As斑塊中缺氧或間歇性低氧可促進巨噬細胞滯留于斑塊，缺氧可以抑制巨噬細胞遷出As斑塊，影響巨噬細胞遷移抑制因子和巨噬細胞游走抑制因子表達[4]。神經軸突導向因子1(netrin-1)及受體UNC5b在巨噬細胞/泡沫細胞滯留動脈粥樣斑塊中起重要作用[3]。鈉氫交換體1(sodium hydrogen exchangers 1，NHE1)通過調控人和哺乳動物細胞內pH的動態平衡影響細胞的形態和功能。因此，深入探討As斑塊中導致巨噬細胞滯留的新機制，對于尋求抗As治療的新策略具有重要意義?，F就NHE1與netrin-1在As中的作用予以綜述。

1 As的發病機制

1.1免疫反應 As發展的新免疫學假定在1997年就已出現[5]，與晚期內膜As斑塊相關的免疫浸潤證明了免疫反應存在于As中[6]。然而，對主動脈中免疫細胞的存在及功能的了解卻很少。Galkina等[7]采用流式細胞儀定量分析證明了在正常、非炎癥的c57bl/6小鼠主動脈中存在巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞。Jongstra-Bilen等[8]證明，正常膽固醇血癥C57BL/6小鼠(3～6月齡)的外膜含有T細胞和巨噬細胞的聚集，為非炎癥外膜中存在的體質免疫細胞提供了進一步的證據；在As背景下，載脂蛋白E-/-與C57BL/6小鼠相比，巨噬細胞和樹突狀細胞的百分比增加，但T細胞的百分比沒有變化，B細胞的百分比降低，這表明免疫細胞的類型與小鼠發生As的傾向之間存在聯系。此外，研究顯示，B淋巴細胞駐留在主動脈外膜中可能限制早期和過度的As[9]。但需要對正常人體動脈外膜進行更多的研究，以充分描述免疫細胞在As發展中的特征。

1.2感染 除了充分記載的遺傳和環境因素外，微生物感染在As的發生、發展中也具有重要作用，這是由于As是一種慢性炎癥性疾病，涉及各種炎癥細胞和因素。細菌感染通過損傷血管內皮和激活全身及局部炎癥免疫反應來促進As的發生和進展。Evani和Ramasubramanian[10]研究顯示，由感染和高脂血癥引起的膜生物物理變化是肺炎支原體加重As病理的關鍵機制之一。這些發現描述了“傳染性負擔”在As發展中的作用。

1.3缺氧 20世紀40年代，有學者提出了動脈斑塊缺氧學說，但直到21世紀，學者們才運用新穎的缺氧標志物證實了兔As斑塊中缺氧的存在[4]。Parathath等[11]研究發現，小鼠As斑塊中存在缺氧，且缺氧可調節巨噬細胞的脂質代謝及基因表達。Sluimer等[12]通過給頸動脈粥樣硬化患者注射細胞缺氧標志物哌莫硝唑，發現As斑塊中存在缺氧；Marsch等[13]通過小鼠實驗進一步證實斑塊中缺氧的存在，并參與斑塊不穩定的形成；缺氧參與As的主要發病機制是炎癥改變，炎癥導致缺氧發生，缺氧的巨噬細胞又釋放炎癥介質。研究發現，As患者的缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α表達增加，而HIF-1存在于巨噬細胞及巨噬細胞衍生的泡沫細胞中，可促進炎癥反應的發生、平滑肌細胞的遷移和增殖以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 表達的增加，進而促進新生血管的形成[13]。VEGF是重要的血管生成因子，普遍存在于內皮細胞、血小板等細胞表面，VEGF的陽性區域與內膜血管、斑塊內出血的數量具有顯著相關性[14]。HIF-1作為VEGF的調控因素可以通過HIF-1/VEGF/VEGF受體2通路促進血管生成，增加斑塊的易損性[15]。Marsch等[13]發現逆轉斑塊缺氧可以抑制As斑塊向脆弱表型的進展；此外，小鼠斑塊巨噬細胞從As開始就處于低氧狀態，進一步證實了缺氧與As斑塊的發生、發展存在因果關系。

缺氧可導致ATP耗竭、乳酸堆積、增加蛋白降解和血管新生等，從而促進As斑塊的發生、發展；缺氧誘導巨噬細胞炎癥介質釋放，募集淋巴細胞、平滑肌細胞或內皮細胞增殖與遷徙，吞噬脂質的細胞釋放更多的促炎癥因子，促進斑塊炎癥放大；此外，缺氧時鈣蛋白酶(calpain)的活性增強，這可能因為缺氧時細胞溶質中的鈣離子濃度增加，而微量鈣離子激活了calpain-1[16]。calpain可使HIF-1α積聚，而這種積聚可能涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶作用以及NADPH活化后一系列鈣離子信號通路的激活。在缺氧過程中，NADPH氧化酶大量激活calpain，一方面使HIF-1α積聚，另一方面大量激活的calpain作用于PEST序列，使ATP結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)降解，從而阻止脂質流出，使細胞泡沫化[17]。而As以單核細胞/巨噬細胞等細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白膽固醇等形成泡沫細胞，并以持續滯留動脈壁為主要特征[2]?？傊?，缺氧通過多途徑參與As的形成與發展。

2 netrin-1、NHE1與As相關性的研究進展

2.1netrin-1與NHE1簡介

2.1.1netrin-1 netrin-1是一種層粘連蛋白，在胚胎發育過程中表達，以引導神經細胞的移動。netrin-1至少存在9種可能受體，如結直腸癌缺失(deleted in colorectal cancer，DCC)蛋白受體、再生蛋白受體、UNC5a-d、唐氏綜合征細胞黏附分子等。netrin-1通過與不同受體結合，產生化學吸引和排斥作用。例如，受體UNC5介導神經軸突生長排斥作用，而受體DCC介導神經軸突生導引或排斥作用，netrin-1受體UNC5在免疫細胞高表達，受體DCC低表達或無表達，故UNC5抑制免疫細胞遷徙在免疫調節及炎癥中發揮重要作用[18]。

2.1.2NHE1 NHE1廣泛分布于各種細胞的細胞膜，是一種具有815個氨基酸、由2個主要結構域組成的長多肽。NHE1基因分子結構中含有兩個功能區域，即疏水的N端和親水的C端，NHE的C端(由50～450個氨基酸組成)是細胞質調節區域，在NHE參與信號通路調控中發揮作用；此外，C端還決定NHE1進行Na+/H+交換的細胞內pH調定點(7.0～7.1)，當細胞內pH值低于調定點時，H+與C端功能域結合激活Na+/H+交換活性，從而決定細胞內pH水平；當細胞內pH值正常時，NHE1的活性較低，但當pH值下降到6.7時，其活性可較前增加10倍[19-21]。NHE1在心血管疾病方面的研究較多，如在心力衰竭、高血壓、肺動脈高壓、缺血再灌注等方面都有相關研究報道，此外，在腫瘤、炎癥等方面也有不少研究[22-24]。

2.2netrin-1介導動脈斑塊巨噬細胞滯留 多項研究發現了netrin-1在非神經系統方面的研究價值，netrin-1在血管、器官的生成、腫瘤的診斷和預后以及肺部炎癥、急性腎損傷的表達和調節等方面均起著重要作用[25-28]。Ly等[29]研究發現，在急性金黃色葡萄球菌感染時，靜脈內皮細胞netrin-1的表達下調，與UNC5b受體結合可抑制其遷移，從而發揮抗炎效應。Rosenberger等[30]在缺氧模型中再次證實，上皮細胞表達的netrin-1可抑制白細胞的聚集。van Gils等[31]研究發現，人和小鼠As斑塊的巨噬細胞中均分泌netrin-1，激活netrin-1及其受體UNC5b可抑制巨噬細胞對CC趨化因子配體2的定向遷徙，抑制斑塊巨噬細胞凋亡；進一步研究發現，基因剔除骨髓來源細胞的netrin-1，可促進巨噬細胞從斑塊中遷移，降低斑塊中巨噬細胞的水平，顯著減少低密度脂蛋白受體-/-小鼠的粥樣斑塊。Ramkhelawon等[32]進行的免疫染色顯示，在低氧環境中，netrin-1和UNC5b在人和小鼠斑塊缺氧區域的巨噬細胞中表達，在體外用氧化型低密度脂蛋白或氧化應激誘導物處理的巨噬細胞中netrin-1和UNC5b信使RNA上調，且netrin-1在低氧條件下抑制巨噬細胞凋亡與HIF-1存在直接相關性；而高水平netrin-1基因的傳遞可以減少單核細胞的積累，以及炎癥、斑塊的形成；而且通過對人As病變的免疫組織化學分析，發現巨噬細胞/泡沫細胞中netrin-1的豐富表達，重組netrin-1可通過UNC5b受體阻止單核細胞遷移。在此基礎上的研究進一步證實，netrin-1在As斑塊巨噬細胞潴留中起重要作用[31-32]，但netrin-1抑制巨噬細胞遷徙的具體機制目前尚未完全明確。另有研究顯示，內皮細胞表面表達的netrin-1會參與內皮細胞屏障作用，在As初期抑制單核細胞向動脈內膜遷移，進而抑制As形成[33]。Oksala等[34]的臨床數據顯示，冠狀動脈疾病患者As斑塊中netrin-1下調，UNC5b上調，且netrin-1的表達與炎癥標志物呈負相關，尤其與M2標志物呈負相關，進一步證明在巨噬細胞中netrin-1及其化學排斥受體UNC5b的表達失調與As和不穩定的發展有關。Moore和Fisher[35]研究顯示，巨噬細胞中netrin-1的缺失表達與斑塊中平滑肌細胞的減少有關，并促進斑塊巨噬細胞移出。綜上所述，在心血管領域netrin-1可以促進血管生成，加速As，同時可保護心臟免受缺血再灌注損傷，并減少梗死面積。這些發現使神經免疫引導線索netrin-1成為一個重要的治療靶點[36]。

2.3NHE1激活參與As斑塊的發展 NHE1參與許多復雜的生理、病理過程，對維持機體正常的功能狀態有重要的生物學意義[37-40]。另有相關研究表明，小鼠巨噬細胞系及大鼠心肌微血管內皮細胞在缺氧條件下NHE1信使RNA及蛋白水平增加，而且在HIF-1重組腺病毒感染人臍靜脈內皮細胞中NHE1表達顯著升高；同時，缺氧可升高NHE1表達、細胞內鈣離子濃度及calpain活性，NHE1激活可促進膽固醇逆轉運的重要分子ABCA1降解，而阿米洛利可抑制NHE1活性，從而延緩ABCA1降解[41-42]。也有研究表明，阿米洛利通過阻斷NHE1活性而抑制內皮細胞凋亡，顯著減輕脂多糖誘導的As斑塊形成；此外，相關研究顯示，普羅布考可通過抑制NHE1而抑制脂多糖，加速As，并促進體內斑塊的穩定性[43]。Karki和Fliegel[44]觀察缺氧/復氧后NHE1的表達情況，結果發現，NHE1蛋白表達增加使細胞更容易受到缺氧/復氧誘導的心肌細胞的損傷。這些研究表明，NHE1激活可能是As斑塊發生的重要事件。

2.4NHE1參與netrin-1抑制定向遷徙的機制 神經軸突形態發生是神經發育的重要環節，軸突末端稱為生長錐，生長錐對于軸突生長方向至關重要。Sin等[45]研究表明，神經細胞系PC12及小鼠新皮質神經元生長錐部位NHE1表達及活性均顯著升高，NHE1抑制劑阿米洛利可減少生長錐偽足數量，抑制神經軸突形成；netrin-1可顯著促進神經軸突生長；NHE1剔除小鼠神經元，netrin-1誘導早期神經軸突生長異?？杀籒HE1過表達所逆轉。這些結果表明，NHE1是netrin-1誘導神經軸突早期形態發生及神經軸突生長所必需的。NHE1與netrin-1可協同調節細胞形態改變，而細胞形態改變是細胞遷徙所必需的，故兩者可能協同調節細胞遷徙運動。研究顯示，斑塊中缺氧巨噬細胞可同時上調netrin-1和NHE1表達，而netrin-1可抑制巨噬細胞遷徙，推測NHE1極有可能通過某種特定機制參與或調節netrin-1的這一效應[42]。

此外，細胞遷徙過程中涉及多個事件的協同調控，如細胞極化、骨架蛋白重排以及局部黏附斑重塑等。細胞定向遷徙運動中，細胞形態改變(如細胞空間結構不對稱)是必需的，細胞需形成明確的細胞前沿及拖尾(即細胞形態極化)。細胞膜G蛋白偶聯受體激活，進而激活Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(如RhoA)及效應分子Rho激酶，進而促進黏著斑蛋白的磷酸化，調節骨架蛋白重組[46]。Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括Rho關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)Ⅰ/ROCKⅡ。細胞前沿的Rho激酶等信號放大以及F-actin聚集，是細胞極化建立過程中細胞膜突觸形成的驅動力，而NHE1在細胞運動的早期細胞極化中發揮整合細胞遷徙信號的重要作用[45]。研究表明，NHE1和埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)直接相聯系，并共定位在片狀偽足，ROCK激活可促進NHE1向片狀偽足前沿聚集[46]；而且NHE1能協同整合遷徙信號，通過RhoA/ROCK信號途徑以及局部calpain活性改變等放大片狀偽足的不對稱信號，啟動F-actin重組，加速局部黏著斑重組裝[47]。另外，遷徙細胞的前沿片狀偽足中Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶與NHE1活性之間形成正反饋，促進細胞形態極化[48]。在netrin-1誘導神經軸突生長中，RhoA/Rho激酶信號通路發揮著重要作用[49-50]。神經生長中，netrin-1/DCC激活RhoA/Rho激酶通路信號，該通路激活可介導netrin-1誘導ERM磷酸化，而ERM蛋白組分中Ezrin表達缺失可抑制神經生長[51]。Rho激酶介導ERM蛋白磷酸化可直接結合NHE1的胞內區域，進而促進骨架蛋白F-actin組裝及細胞骨架改建，而UNC5b主要抑制免疫細胞對多種細胞趨化因子的定向移動[19]。鑒于UNC5b介導netrin-1信號及效應很大程度上具有DCC介導的相反信號及效應的特點，而且遷移細胞前沿NHE1聚集可通過RhoA/ROCK等信號調節，在細胞極化發揮整合細胞遷徙信號的功能[20]，推測，netrin-1激活受體UNC5b，使RhoA/ROCK通路信號被抑制，從而抑制細胞膜NHE1極性分布，導致ERM蛋白磷酸化被抑制，進而抑制細胞極化及細胞遷移。

3 小 結

目前國內外關于NHE1/netrin-1相關性的研究較少，尤其是心血管疾病方面。netrin-1對早期神經突起形態發生的促進作用受到NHE1表達和活性降低的抑制，而netrin-1誘導早期神經軸突生長異?？杀籒HE1過表達所逆轉。netrin-1可介導動脈斑塊巨噬細胞滯留，同時NHE1與As斑塊形成密切相關。通過不斷的研究，可以揭示NHE1分子的重要功能位點在netrin-1介導巨噬細胞潴留中的作用及機制；同時，將斑塊內pH值調控分子與巨噬細胞潴留直接聯系起來，可以更好地豐富和發展As斑塊缺氧生物學的重要理論意義。希望從干預缺氧/netrin-1/NHE1的獨特視角為尋求As及相關疾病防治提供新的策略。