維生素K2通過降低D-雙功能蛋白活性抑制肝癌的實驗研究

孔令玉，路欣，姜玲玲

維生素K2(vitamin K2,VK2)是一種脂溶性維生素。研究已經證明,VK2對包括肝癌在內的許多腫瘤細胞增殖具有抑制作用[1]。盡管，有關VK2抑制肝癌細胞增殖分子機制研究涉及抑制核轉錄因子、細胞周期調節蛋白和信號通路等多種學說[2-5]，但仍存在有待解決的問題。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是發病率較高的腫瘤之一，其惡性程度高，致死率極高，并且具有術后預后差等特征，目前已經成為全球第二大致死性癌癥[6-7]。近年來醫學界對于其發病機制和靶向治療的研究受到了越來越多的重視，但由于特異性基因診斷較少，而且針對于某些基因研發的靶向治療藥物效果欠佳，因此，探討肝癌的致病機制和尋找更安全有效的治療藥物具有重要的臨床意義和應用價值。

D-雙功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)作為一種重要的氧化還原代謝酶，能夠促進雌二醇(E2)脫去氫離子而失去活性，因此，生物體內雌二醇量的改變可作為DBP活性增減的指標。實驗研究表明，DBP在肝癌HepG2細胞明顯高表達，且能夠降低雌二醇表達水平促進肝癌細胞增殖[8]。而且肝癌患者中DBP的表達與腫瘤標志物的表達具有良好的相關性，因此，DBP很有可能成為肝癌診斷和治療的新靶點[9]。最近一項研究報道，HepG2細胞內VK2可與DBP相結合而影響其活性[10]，因此VK2很有可能通過與DBP相互作用，降低其活性，上調E2水平，來發揮其抑制肝癌細胞增殖的作用[11]。因此本研究探討了VK2對DBP過表達引起的肝癌細胞增殖的抑制機制，為DBP作為肝癌診斷和治療新靶點提供了更有利的實驗依據，為VK2和DBP作為預防和治療肝細胞肝癌的分子機制提供更好的基礎證據和靶向治療方向，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞與分組：人源的肝癌細胞HepG2實驗細胞由中國醫學科學院(北京協和醫學院)腫瘤研究所提供。將細胞分為過表達DBP組(DBP組)和empty組及敲低DBP組(siDBP組)和siNC組，過表達DBP組和敲低DBP組分別給予0～100 μmol/L 不同濃度的維生素K2處理。

1.1.2 實驗試劑：DBP質粒(本實驗室保存)；小干擾RNA(siRNA)，siD-雙功能蛋白(siDBP)：上游5′GUACCUUUGUAUUUGAGGAdTdT3′，下游5′UCCUCAAAUACAAAGGUACdTdT3′，siNC：上游5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3′，下游：5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3′(上海生物工程技術公司)；Lipofectamine 2000TM轉染試劑(美國Invitrogen公司)；兔源-抗人DBP單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔源-抗人β-actin多克隆內參抗體(美國Santa Cruz公司)；CCK-8試劑(日本ojindo公司)；雌二醇(E2)(美國Sigma公司)；125碘(125I)雌二醇放射免疫試劑盒(天津九鼎公司)；維生素K2(北京百靈威科技公司)。

1.2 細胞轉染 將HepG2細胞種在孔板中，于37℃、5 % CO2條件下培養24 h，待細胞生長至70 %左右融合度時進行轉染。首先按照轉染試劑的說明將適量的質粒[空載體質粒(Empty)和過表達質粒(DBP)]、小干擾RNA[對照小干擾RNA(siNC)和目的小干擾RNA(siDBP)]分別溶于無血清無抗生素的RPMI1640培養液中，混勻。將與轉染試劑同濃度的Lipofectamine 2000TM溶于無血清無抗生素RPMI1640培養液中，混勻，室溫靜置5 min。將上述4種轉染試劑分別與脂質體混勻，室溫靜置20 min。最后將孔板中原有的培養基棄去，并用新鮮無血清無抗生素RPMI1640培養基洗滌細胞2次，將各組脂質體和質?；旌弦壕鶆虻稳朊靠准毎?，置培養箱37℃培養。6 h后更換為含10 % 胎牛血清的RPMI1640培養基，繼續培養48 h用于后續實驗。

1.3 Western-blot檢測DBP表達 處理后的細胞經過蛋白提取、蛋白定量后用裂解液稀釋成5 μg/μl濃度的懸液，加5×上樣緩沖液95℃煮沸5 min。制作SDS-PAGE，進行蛋白上樣和凝膠電泳，電泳后將蛋白膠轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉進行封閉，分別加兔抗人DBP和β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃冰箱過夜溫育，TPBS洗膜，用熒光二抗進行室溫靜置孵育1 h (1∶5 000)，用TBST洗膜2次，每次約10 min，最后Odyssey發光儀進行掃描。

1.4 細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測 按照說明書將CCK-8試劑與無血清的RPMI1640培養基以1∶4的比例混合，將轉染后培養48 h的96孔板中的培養基去除，每孔加入100 μl CCK-8的混合液，于37℃、5 % CO2條件下培養4 h。最后用酶標儀在450 nm處讀取吸光度值。

1.5 E2水平檢測 按照E2放射免疫試劑盒的說明，取8個試管，分別標記為總T、NSB、S0、標準品S1、標準品S2、標準品S3、標準品S4、標準品S5，按照試劑盒說明，分別加入稀釋緩沖液，標準品10、50、100、250、750 pg/ml、標記物及抗體，充分混勻，置于37℃ 1.5 h后加入分離劑充分混勻，4℃ 3 600 r/min離心20 min，棄上清液，在γ計數儀上測定各管的放射性活度強度(cpm)。以cpm讀數為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。取待測培養基200 μl，代替標準品，加入標記物及抗體，充分混勻，置于37℃ 1.5 h后加入分離劑充分混勻，4℃ 3 600 r/min離心20 min，棄上清液，在γ計數儀上測得cpm值，利用標準曲線得出待測樣品E2的含量。結果以每毫升樣品含有E2的量 (ng/ml) 表示。

2 結 果

2.1 DBP高表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響 Western-blot實驗結果顯示，DBP過表達質粒和干擾RNA轉染HepG2細胞后，能夠有效干預DBP的表達(圖1A、B)。CCK-8分析實驗證明，DBP過表達和敲低能相應地增加(1.76±0.22 vs. 1.83±0.27，P<0.05)和減少(1.84±0.25 vs. 1.77±0.21，P<0.05)細胞的數量(圖1C、D)。

2.2 DBP高表達對細胞E2分泌的影響 結果顯示，DBP過表達降低了細胞E2分泌水平[(20.76±3.42)ng/ml vs.(17.23±2.65)ng/ml,P<0.05]。

2.3 維生素K2對肝癌細胞增殖的影響 CCK-8分析結果顯示，與對照組(Empty)相比，DBP過表達組HepG2細胞增殖加強(P<0.05)，當分別給予不同濃度的VK2(0、1、10、30、50、100 μmol/L)處理48 h后，細胞的增殖呈濃度依賴性降低(P<0.05)(圖2 A)；用siRNA敲低了DBP的表達后，細胞的增殖明顯降低(P<0.05)，但是VK2的處理對細胞的增殖影響不大(P>0.05)(圖2 B)。

2.4 不同濃度VK2對E2、DBP表達的影響 用不同濃度的VK2(0、20、50、100 μmol/L)處理對照組(Empty)和過表達DBP組的HepG2細胞 48 h后，檢測培養基中E2的水平。結果顯示，隨著VK2劑量的增加，培養基中E2水平也隨之增加(P<0.05)(圖3 A)。但是用100 μmol/L濃度的VK2分別處理Empty組和過表達DBP 組的HepG2細胞后，DBP蛋白表達無明顯變化(圖3 B)。

3 討 論

肝細胞癌作為致死性較高的癌癥，在全球約排在第3位，男性患病率高于女性，而觀察發現肝細胞癌的發病也與地域性相關，因其預后較差，成為影響人民健康的重要威脅[12]。盡管近年來肝癌切除手術有一定的進展，但是患者的術后生存質量和5年生存率并不高[13]。最初發現VK是在血液凝固的過程中發揮作用，并且有研究報道其對骨骼健康及心血管疾病有積極作用[14]。此外，近年有相關研究表明，維生素K在腫瘤的形成和生長過程中有抑制作用，特別是VK家族中的VK2在肝細胞癌的增殖中表現出抑制作用[15-16]。

注：A.DBP過表達質粒(DBP)轉染HepG2細胞Western-bolt檢測DBP表達；B.DBP干擾RNA(siDBP)轉染HepG2細胞Western-bolt檢測DBP表達；C. DBP /Empty質粒轉染HepG2細胞后CCK-8檢測細胞增殖；D.siDBP/siNC轉染HepG2細胞后CCK-8檢測細胞增殖有報道顯示，維生素K2的類似物四烯甲萘醌不僅可以抑制肝癌的進展，更重要的是能降低肝癌術后的復發率和轉移率[4-5]。這些研究結果表明，VK2在HCC的治療和術后康復中發揮了潛在的抗腫瘤特性。

圖1 DBP過表達對肝癌細胞增殖的影響

注：A. DBP過表達質粒/空質粒處理HepG2細胞后加入不同濃度VK2，CCK-8檢測細胞增殖；B.siDBP/siNC干擾RNA處理HepG2細胞后加入不同濃度VK2，CCK-8檢測細胞增殖

圖2 維生素K2對肝癌細胞增殖的影響

注：A. DBP過表達質粒/空質粒處理HepG2細胞后加入不同濃度VK2，放射免疫檢測E2水平；B.DBP過表達質粒/空質粒處理HepG2細胞后加入100 μmol/L VK2，Western-bolt檢測DBP表達

圖3 維生素K2對肝癌細胞中DBP活性的影響

D-雙功能蛋白(DBP)是生物組織細胞器過氧化物酶體中極其重要的一種氧化還原酶。DBP在哺乳動物的肝、心臟、腦、前列腺等組織中都有表達。更重要的是DBP可以催化雌二醇(E2)脫氫失去活性，從而產生雌酮[11]。以往研究也發現，人肝癌病理組織中DBP高表達，肝癌HepG2 細胞中DBP表達升高從而降低E2水平表達后，使促癌細胞增殖基因cyclin D1及PCNA等的表達明顯升高，而這些最終導致了肝癌細胞的增殖[8-9]。最近有研究發現，合成后的生物素VK2能夠與DBP相結合導致DBP活性降低[10]。本實驗中，VK2與DBP相互作用降低DBP的活性，進而使細胞內E2的水平顯著增加，進而起到了抑制HCC細胞增殖的重要作用。

綜上，維生素K2對肝癌細胞增殖有較好的抑制作用。VK2通過與DBP相互作用，降低了DBP的催化活性，升高了E2的表達水平，從而抑制肝癌細胞的增殖。本研究初步闡明VK2通過DBP抑制肝癌細胞增殖的相關機制，為肝癌的診斷和術后聯合監測提供新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

路欣：實施研究過程，論文撰寫和修改；孔令玉：實施部分實驗，分析實驗數據，統計學分析；姜玲玲：設計研究思路，論文審核