苯并三唑對鎘在小油菜中的蓄積和毒性的影響

王 嬌，趙 爽，段鑫越，王予頔，秦 莉，安 毅，端正花*

（1.天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津 300384；2.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191）

苯并 三唑（Benzotriazole，BTR）及 其衍 生 物（BTRs）在醫藥、農藥、材料、生物染色劑和離子受體等多個領域具有廣泛的潛在應用[1-2]。例如美國每年BTRs的平均總產量高達9000 t[3]。由于其龐大的生產量及各種消費和工業產品廣泛的使用，BTRs對環境的污染日益受到重視。Wang等[4]研究發現，美國和東亞地區的室內灰塵總BTRs的濃度大約在20～90 ng·g-1，而中國室內灰塵中的濃度最高能達2000 ng·g-1。世界范圍內淡水和海洋環境中BTRs的總濃度約為0.08～200 μg·L-1[5-6]。含有甲基的BTRs在人體脂肪組織中也被廣泛檢測到[7]。BTRs的急性毒性較低，但是會產生各種慢性毒性[8]。研究發現BTR具有發育毒性、致突變性和內分泌干擾特性，被列為環境可疑致癌物[9-10]。

BTRs芳香環上的氮硫雜原子上有孤對電子，易與各種重金屬離子或受體結合。兩者結合后的聯合毒性效果還存在爭議。大部分工作認同有機絡合可以顯著降低重金屬的毒性，因為金屬與有機試劑的絡合降低了其游離形態的濃度。如Haghighi等[11]研究發現天然水體中腐植酸（HA）可降低Cd的毒性。作者前期研究發現5μmol·L-1苯并三唑在斑馬魚胚胎24 h血液流動發育和56 h死亡率這2項指標上都會顯著降低1μmol·L-1Cd的毒性[12]。另一方面，有機物與重金屬的螯合作用會提高重金屬的富集率和生物有效性。陳敏等[13]發現分子量相對較小的螯合劑二乙氨基二硫代甲酸鈉（DDTC）與Cd螯合后，會導致Cd濃度增加，從而能產生各種不良反應。

隨著水體和土壤污染問題的日益突出，人們對污染物引發的食品安全日趨關注。當前，農作物遭受重金屬污染的生理生態毒性及其治理措施備受重視，重金屬與新興污染物對農作物聯合毒性的研究已經有很多[14]。芥菜型小油菜是我國廣泛食用的常見蔬菜，有研究表明小油菜對Cd有富集能力，且Cd能夠在小油菜體內進行遷移[15]。BTR是一種廣泛應用的金屬緩蝕劑[16]。盡管這兩種污染物在水體和土壤環境中經常被檢測到，但是它們對蔬菜的聯合效應還未見報道。因此，本研究以可食蔬菜上海青小油菜（Brassica campestrisL.）為研究對象，從小油菜生長狀況、Cd的蓄積以及抗氧化酶和金屬硫蛋白（MT）表達這3個方面探討了BTR和重金屬Cd的聯合毒性效果，并從不同次序聯合暴露方式下Cd形態變化的角度分析其聯合作用機制，以期為農業生產中BTR存在條件下重金屬對作物毒性效應的研究提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

選用上海青小油菜（Brassica campestrisL.）作為供試植物，種子購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。塑料花盆購自天津市某花卉市場?；ㄅ璩叽鐬?5 cm×20 cm×30 cm。

本試驗中氯化鎘（CdCl2）、氯化銀（AgCl）和苯并三唑（1-H-benzotriazole，BTR）為分析純（純度＞99.9%），購于Sigma-Aldrich公司。稱取一定量的粉末溶于重組水中，稀釋到需要的濃度。根據水體環境中重金屬的實際濃度和預試驗結果，本試驗中CdCl2的暴露濃度為0.1、0.5、1.0、5、10 μmol·L-1，BTR的暴露濃度為5 μmol·L-1。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設置

1.2.1 育苗

挑選籽粒飽滿一致、無蟲害、無破損的種子，用5%H2O2浸泡20 min，然后用去離子水沖洗干凈。將種子整齊地排列在鋪有一層濾紙的托盤中，使每粒種子間保持勻稱的距離，保證與溶液的接觸面積和充足的成長空間，托盤放入26℃恒溫培養箱中。每日向托盤中加入適量相應濃度霍格蘭培養液，保持濃度、濕度等適宜生長的條件穩定?；舾裉m培養液成分有NH4NO3（0.71 mmol· L-1）、NaH2PO4（0.32 mmol· L-1）、K2SO4（1.02 mmol· L-1）、Ca（NO3）2（0.5 mmol· L-1）、MgSO4（0.65 mmol·L-1）、MnCl2·4H2O（2 μmol·L-1）、（NH4）6· Mo7O24· 4H2O（0.1 μmol· L-1）、H3BO3（8.5μmol·L-1）、ZnSO4·7H2O（0.1 μmol·L-1）、CuSO4·5H2O（0.2μmol·L-1）和FeCl3（5.8μmol·L-1）。托盤培養一周至幼苗5 cm左右，然后進行移栽。選取大小均等的20株幼苗移栽到溫室的花盆中，自然光照下生長，具體如圖1所示。

1.2.2 試驗暴露

圖1 試驗設置Figure 1 Experiment setup

為降低無機陽離子對Cd離子的潛在影響，暴露試驗中培養液濃度稀釋為上述霍格蘭培養液濃度的1/4。試驗先進行 Cd（0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol·L-1）和BTR（5 μmol·L-1）的單獨暴露，然后進行Cd和BTR的聯合暴露（Cd濃度為 1μmol·L-1，BTR濃度為5μmol·L-1），每組取3個花盆作為3個平行，每盆選取大小均等的20株幼苗進行移栽，溫室自然光照下生長。隔天更換溶液。聯合暴露包含3種次序暴露，具體如表1所示。

1.3 測試指標

1.3.1 生長狀況

暴露35 d后，單獨和聯合暴露組每組每盆隨機計數10棵小油菜，測定其莖長，計算3盆的平均值和標準誤差值以表征結果。

1.3.2 Cd含量測定

將采集的每組小油菜用蒸餾水沖洗干凈后放入烘箱中，在105℃殺青30 min、80℃下烘至恒質量后研碎。分別稱取0.25 g干質量上述樣品，加入混合酸（7 mL 65%～68%的HNO3和2 mL 30%的H2O2）浸泡過夜，轉入消解罐中，110℃下消解約7 h，180℃加熱趕酸后取下冷卻，定容至25 mL。用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-OES）測定每組樣品中Cd的濃度。Cd的檢出限為0.002 mg·L-1，加標回收率94%～105%。Cd的富集倍數以蔬菜體內的Cd含量（干質量）與相應的暴露濃度之比表示。

1.3.3 抗氧化酶和金屬硫蛋白的測定

（1）抗氧化酶POD、SOD和CAT的測定

聯合暴露組隨機選擇每組每盆3棵油菜，摘取所有葉片，用蒸餾水洗凈后晾干。每組隨機稱取0.2 g葉片，用剪刀剪碎置于研缽中，加入液氮充分研磨后全部轉移至5 mL離心管。加入3.5 mL蛋白質提取液（15 mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、25 mL甘油、2 g聚乙烯吡咯烷酮）、4℃條件下3500 r·min-1離心45 min，提取總蛋白。然后按照超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒說明測定相應蛋白濃度。

（2）金屬硫蛋白（MT）的測定

聯合暴露組隨機選擇每組每盆3棵油菜，摘取所有葉片，用蒸餾水洗凈后晾干。每組隨機稱取0.2 g葉片，加入液氮充分研磨。取0.6 mL待測樣品溶液于2 mL離心管中，加入0.6 mL甘氨酸緩沖液和0.5 mL 20μg·mL-1AgCl溶液，室溫放置5 min；再加入100 μL血紅蛋白溶液，混合均勻，80℃水浴加熱5 min，然后冰浴5 min。室溫條件下，12 000 r·min-1離心 5 min，取上清液；再加100μL血紅蛋白溶液重復提取1次。合并上清液并用5 mL HNO3（65%～68%HNO3）消解，用ICP-OES測定每組樣品中銀離子的濃度。

1.4 統計分析

每個試驗組設3個平行樣。采用SPSS17.0軟件進行數據分析，結果用均值±標準誤差的形式表示；組間用Student-t檢驗，P＜0.05表示有顯著差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 Cd單獨暴露

2.1.1 Cd對小油菜的生長影響

小油菜暴露35 d后，其生長狀況如圖2所示?？梢?，空白對照組的小油菜生長較好，莖葉平均長度為21 cm。相對空白對照組，0.1μmol·L-1Cd暴露對小油菜的生長有著顯著的促進作用（P＜0.05），莖葉平均長度為25.33 cm，莖葉增長率為20.63%，即低濃度Cd會對小油菜產生刺激效應。當Cd的暴露濃度增加到0.5μmol·L-1以上時，顯著抑制了小油菜莖葉的生長，并且劑量-抑制效應關系顯著（R2=0.779）。

2.1.2 Cd在小油菜中的蓄積

小油菜暴露35 d后，不同暴露劑量下小油菜中Cd的含量如圖3所示?？梢?，空白對照組中小油菜中的Cd未檢出。隨著Cd暴露劑量增大，小油菜體內Cd蓄積濃度也增大，劑量-蓄積效應關系顯著（R2=0.931）。當 Cd暴露濃度從 0.1 μmol·L-1增加至 10μmol·L-1時，小油菜組織中的Cd 蓄積量由11.05 mg·kg-1增加到 223.22 mg·kg-1，增加了約20倍。但是從蓄積倍數這個指標來看，最低暴露濃度0.1μmol·L-1時，蓄積倍數最大，約為110.47。當暴露濃度增大到0.5μmol·L-1以上時，蓄積逐漸飽和，蓄積倍數呈現負相關關系（R2=0.917）。即小油菜在低濃度Cd暴露下刺激吸收、高濃度Cd暴露時抑制吸收。

表1 暴露設置Table 1 Exposure setup

圖2 不同濃度CdCl2作用下小油菜的莖葉長度Figure 2 The stemlength of the rapes affected by different concentrations of CdCl2

圖3 不同濃度CdCl2作用下小油菜中Cd的蓄積Figure 3 The Cd bioaccumulation in the rapes affected by different concentrations of CdCl2

2.2 Cd與BTR聯合暴露

2.2.1 小油菜生長狀況

圖4 Cd與BTR聯合作用下小油菜的莖葉長度和Cd的蓄積Figure 4 The stemlength and Cd bioaccumulation in BTRand Cd joint exposureto the rapes

Cd與BTR聯合暴露35 d后，小油菜莖葉長度如圖4所示。5μmol·L-1BTR暴露組莖葉平均長度為20.05 cm，與空白對照組相比無明顯變化（P＞0.05），因此BTR對小油菜的生長發育無顯著影響。1μmol·L-1Cd單獨暴露下小油菜植株顯著變矮（P＜0.01），莖葉長度為17.1 cm。聯合暴露組中，Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd各組的莖葉長度分別為18.1、18.6、16.9 cm，即Meantime、Cd/BTR這兩種暴露次序能降低Cd對小油菜的生長抑制（P＜0.01），而BTR/Cd組降低Cd對小油菜的生長抑制效果不顯著（P＞0.05）。積

2.2.2 Cd在小油菜中的蓄積

如圖4所示，空白對照組和BTR單獨暴露組小油菜中的Cd未檢出。不同次序聯合暴露改變了Cd在小油菜中的蓄積。Cd單獨、Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd各組中Cd的含量分別為24.09、20.86、21.50、24.51 mg·kg-1。即Meantime、Cd/BTR組能降低Cd在小油菜中的蓄積（P＜0.01），而BTR/Cd組卻不能（P＞0.05）。2.2.3 Cd與BTR聯合暴露對小油菜體內酶活的影響

試驗選擇了SOD、CAT和POD這3種典型的抗氧化酶和金屬硫蛋白MT為研究對象，以探討不同次序聯合暴露毒性差異的機制。如圖5所示，5μmol·L-1BTR對小油菜產生了一定的氧化性壓力，表現在SOD酶的表達顯著受到抑制、含量相對空白對照組降低了7.67%（P＜0.01），但是CAT和POD的表達都無顯著變化（P＞0.05）。1μmol·L-1Cd單獨暴露下小油菜SOD、CAT酶表達受到抑制，含量相對空白對照組分別降低了28.39%（P＜0.01）和65.46%（P＜0.05），POD酶含量卻升高了24.84%（P＜0.01），證明1 μmol·L-1Cd對小油菜產生更為顯著的氧化性壓力。

圖5 BTR和Cd聯合暴露中抗氧化酶的表達和MT含量的變化Figure 5 The changes of anti-oxidative enzyme expressions and MTcontent in the rapes induced by BTRand Cd joint exposure

Cd與BTR不同次序聯合暴露對小油菜抗氧化酶的表達存在差異。與Cd單獨暴露組相比，Meantime暴露下SOD和POD的表達都顯著降低（P＜0.01），Cd/BTR暴露只有POD酶表達的抑制有所降低（P＜0.05），而BTR/Cd暴露下3種抗氧化酶表達的影響都無明顯差異（P＞0.05）。因此，Cd與BTR不同次序聯合暴露中，Meantime暴露對Cd造成的氧化壓力的降低作用最大，BTR/Cd對Cd造成的氧化壓力的降低作用最小。

Cd與BTR不同次序聯合暴露對小油菜MT蛋白的表達也存在差異。1μmol·L-1Cd單獨暴露下小油菜MT的表達量為8.30 mg·kg-1，相對空白對照組增加了的 84.44%（P＜0.01）。Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd次序聯合暴露中，小油菜葉片中MT的表達量分別為5.52、6.10、6.50 mg·kg-1。因此，Meantime暴露對Cd誘導MT的抑制作用最大，BTR/Cd暴露對Cd誘導MT的抑制作用最小。

3 討論

鑒于BTRs在水環境中的高溶解度（28 g·L-1），和大量暴露且穩定性較高、難降解，BTRs將會在水環境中將會長期存在。雖然BTRs的水生生物毒性引起了極大的關注[17]，但是其對水生生物（綠藻、大型蚤、斑馬魚等）的急性毒性效應報道卻很少[18]，研究的濃度范圍為μmol·L-1級。BTR在可直接食用農作物的蓄積和毒性作用也鮮有報道。Liu等[16]發現500μmol·L-1BTR能夠在水稻幼苗中進行蓄積，并且根部的蓄積量顯著高于莖葉，但是BTR對水稻幼苗的生長沒有影響。因此，BTRs在農業環境中是以低毒的形式存在的。氧化性壓力[19-20]的誘導一直被認為是重金屬在生物體內產生毒性作用機制的重要組成部分。本研究中也發現5μmol·L-1BTR能夠誘導小油菜SOD酶的表達，表現出一定氧化性壓力損傷，但是從小油菜的生長狀況來看無顯著毒性效應（圖4）。

水體和土壤環境中重金屬的有效態以可溶無機離子態和離子可交換態存在。一方面，pH可能是控制土壤中重金屬有效態的主要因素[21]。冉洪珍等[22]發現石灰單施及石灰與有機肥配施均能顯著提高稻田土壤pH值，降低土壤中有效態Cd的含量和水稻各部位Cd的含量，從而降低Cd對水稻的毒性作用。另一方面，環境中有機質的存在可以改變環境中重金屬的有效態，使得重金屬向植物根系的擴散速度等方面受到影響。段明夢等[23]發現土壤中易降解有機質中的有機配位體和Cd2+的絡合作用增加了有效態Cd的含量，并進一步促進了高粱地上部對Cd的積累。尹炳奎等[24]在研究中表明，土壤有機物料的降解產物可以顯著增加土壤溶液中可溶性有機碳（DOC）濃度，改變重金屬在其固液相的分布，影響重金屬在土壤中的吸附，從而影響重金屬的生物有效性。Grüter等[25]報道長期施用有機質也會降低小麥中Cd的濃度。

本研究發現，BTR和Cd同時加入的方式能夠降低Cd在小油菜中的蓄積及其對小油菜的毒性效應，表現為Meantime組中Cd對小油菜的生長發育以及SOD、POD和MT表達的抑制作用都顯著降低（P＜0.01）。本試驗對暴露系列的pH值進行了測定，Cd單獨及和BTR聯合暴露的pH值均為6.5左右。前期研究中分析了不同pH值下，Cd和BTR同時暴露且Cd∶BTR=1∶5時水溶液中Cd的離子形態[15]，Cd單獨暴露組中Cd的形態為100%的Cd2+，而Meantime組中Cd的形態為 90% 的 Cd（BTR-）2和 10% 的 Cd2+，因此Meantime聯合暴露組中Cd2+的濃度相對單獨暴露組顯著降低，從而使Cd進入小油菜時的離子有效態降低，導致聯合暴露組中小油菜Cd的蓄積量減低（圖4），最終使得該組中Cd對抗氧化酶和MT的影響都顯著降低（圖5）。

本研究中還發現，暴露次序對于聯合作用效果有重要意義。3種暴露次序中，BTR對Cd在小油菜中的蓄積和毒性的降低表現為Meantime組＞Cd/BTR組＞BTR/Cd組。Cd/BTR這種暴露次序中BTR對Cd在小油菜中的蓄積和毒性的影響略低于Meantime組，表現為與Cd單獨暴露組相比，Cd/BTR暴露只有POD酶表達的抑制有所降低（P＜0.05）。推測Cd/BTR組中，除了預先Cd暴露產生的蓄積和毒性效應以外，后期聯合作用效果與Meantime組類似，在溶液中也主要形成了Cd（BTR-）2，影響了Cd的生物有效性，抑制Cd從溶液中向小油菜根系的傳遞，從而最終導致小油菜莖葉中Cd的含量相對降低。但是，BTR/Cd這種暴露次序與其他兩者卻截然不同。BTR/Cd組中BTR不能降低Cd在小油菜中的蓄積。究其原因，BTR主要是在植物的根部蓄積[16]，一方面，預先暴露的BTR在小油菜根部蓄積后，能夠促進Cd在小油菜根系的累積。Liu等[16]也證實了預先暴露BTR能夠促進Cd在水稻根系的累積；另一方面，溶液中也會形成一定量的Cd（BTR-）2，使得溶液中能夠被根部BTR促進吸收的Cd的總量降低。這兩種效果復合起來，最終使得BTR/Cd組中Cd的蓄積量與Cd單獨暴露組相比無顯著差異。作者前期在Cd和BTR對斑馬魚肝臟的聯合毒性研究中也發現，Meantime這種暴露方式能夠顯著降低Cd在斑馬魚肝臟中的蓄積，而BTR/Cd這種聯合暴露方式卻不能[26]。

農田重金屬的聯合毒性作用效果不僅要考慮自然環境因素的影響，還要考慮由于農業生產過程由于灌溉、施肥、翻耕所帶來的污染物的不同次序暴露的影響。但是目前暴露順序對植物吸收重金屬的影響的相關研究仍然有限。Wang等[27]發現先加入銅后加入多溴二苯醚的暴露次序中，由于銅對玉米根細胞膜的預先損傷作用，更多的多溴二苯醚會滲入玉米根系，并在芽中向上移位。

4 結論

（1）5μmol·L-1BTR雖能夠誘導小油菜SOD酶的表達，但是對小油菜最終的生長狀況無顯著毒性效應。

（2）BTR能夠降低Cd在小油菜中的蓄積及毒性效應，但是暴露次序的改變對聯合暴露毒性效果有顯著影響。