具氯氰菊酯降解功能的植物內生細菌分離鑒定及降解特性研究

孫麗娜，黃開華，高新華，陳 偉，白娜玲 ，呂衛光*

（1.上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403；2.上海低碳農業工程技術研究中心，上海 201403）

氯氰菊酯屬擬除蟲菊酯類殺蟲劑之一，是1983年由Shell International Chemical公司（現為BASF）產業化開發[1]，具有廣譜殺蟲作用。氯氰菊酯可用作棉花、蔬菜、果樹、茶樹、大豆等作物上害蟲的防治。對棉花和果樹上的鱗翅目、半翅目、雙翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目等多種害蟲均有較好的防治效果[2]。因此，菊酯類殺蟲劑在世界范圍內得到廣泛應用，目前占我國農業殺蟲劑使用面積的三分之一以上。但過度和廣泛的使用會對人體健康和生態環境安全造成威脅。研究表明，經常接觸氯氰菊酯會產生免疫毒性[3]，而且此類農藥容易在人體內積累，引發各種慢性疾病[4]。近年來，已有多次關于氯氰菊酯蔬菜殘留的報道。李曉莉[5]于2008—2011年間對淄博市蔬菜中擬除蟲菊酯類農藥殘留進行了檢測，其中氯氰菊酯殘留量最高。雷雨等[6]于2016年調查了定西地區市售蔬菜擬除蟲菊酯類農藥殘留，其總檢出率為45.0%，超標率為0.04%，超標農藥主要為氯氰菊酯和高效氯氰菊酯。因此，有關氯氰菊酯殘留的生物修復得到了廣泛關注。

植物內生菌是指真菌或細菌一生中的某個階段能進入活體植物組織內，并在植物內不引起明顯組織變化的微生物[7]。植物內生菌通常歸屬于宿主植物所栽種土壤中普遍存在的特殊屬，是植物組織內的有益菌落[8]。研究表明，植物內生細菌產生的酶類、生長素等次生代謝產物，能調節植物代謝，促進生長，提升植物耐受性[9-11]。與從土壤中分離的降解菌株相比，植物內生菌能有效定殖在植物體內，促進植物對污染物的吸收、轉化和降解，從而減輕污染物對植物的毒害作用。因此，亟需篩選具有氯氰菊酯降解特性的植物功能內生菌。

本研究通過富集篩選得到一株以氯氰菊酯為唯一碳源生長的植物內生細菌，并系統研究了其生物學特性和降解功能，以期為利用功能內生細菌來調控植物代謝氯氰菊酯，進而有效地規避作物污染風險提供新途徑。

1 材料方法

1.1 試驗材料

氯氰菊酯（純度＞98%）購于Sigma公司，甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

供試植株牛筋草 Eleusine indica（L.）Gaertn.，采自上海郊區某農藥廠附近（30°55′N，121°03′E）。植株生長良好，采集后立即帶回實驗室進行菊酯降解菌的分離篩選。

1.2 培養基

根據本實驗需求，查詢相關文獻[12]中培養基的配制，以1000 mL液體培養基為標準。

Luria-Bertani（LB）培養基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母膏，10 g氯化鈉，1000 mL去離子水，pH 7.0～7.2。固體培養基是在每1000 mL液體培養基中加入15～20 g瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

無機鹽培養基（MSM）：0.4 g MgSO4·7H2O，0.2 g FeSO4· 7H2O，0.2 g K2HPO4，0.2 g（NH4）2SO4，0.08 g CaSO4，1000 mL去離子水，pH 7.0～7.2。固體培養基是在每1000 mL液體培養基中加入15～20 g瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

菊酯降解培養基：將菊酯原藥溶于二甲基亞砜（色譜純度）配制成濃度為10 000μL·L-1的母液，過濾除菌，然后加入至已滅菌的MSM培養液，菊酯的終濃度為20 mg·L-1。

1.3 功能植物內生細菌的分離篩選

取適量新鮮的植株樣本，用無菌水將植株表面附帶的灰塵泥土沖洗干凈，使植物表面沒有污跡，然后自然風干。用75%酒精漂洗3～5 min，然后用無菌水沖洗3～4次，再用無菌水沖洗5次。將表面消毒沖洗好的植物組織放置于已滅菌的研缽內研磨，吸取汁液均勻涂布于LB培養基平板上，于30℃條件下避光培養2～7 d。將最后一次沖洗的水涂布到LB培養基上作為對照，以檢驗表面消毒的效果。待長出菌落后挑取單菌落進一步劃線，以菊酯降解培養基來分離純化。選取能連續5次在氯氰菊酯作為唯一碳源的無機鹽培養基上生長的菌株，保存于LB培養基斜面上供進一步研究。利用氣相色譜測定氯氰菊酯的含量，采用稀釋平板法測定菌株的細胞數量，確定降解菌株對氯氰菊酯的降解能力及生長情況。

1.4 菌株的鑒定

將分離得到的降解菌株命名為A-24，并對其進行菌落形態學、細胞形態學觀察[13]及16SrDNA序列同源性比對分析，確定其分類地位。采用高鹽法提取菌體DNA[14]，擴增降解菌株16SrRNA基因序列。引物為16SrRNA基因序列通用引物[15]，正向引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R序列為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。擴增產物用AXYGEN核酸純化試劑盒純化回收，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收的DNA片段純度和大?。s1.5 kb），然后進行TA克隆，測序。TA克隆體系（5μL）為：pMD18-T 0.5μL，DNA片段2μL，Solution I（TaKaRa）2.5μL，16℃酶連過夜。將測序結果在Ez?Taxon（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）上進行在線比對分析[16]。

1.5 菌株A-24降解氯氰菊酯與其生長關系的測定

挑取A-24單菌落接種至含20 mg·L-1氯氰菊酯的100 mL LB培養基中，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養至對數期，6000 r·min-1離心收集菌體，使用MSM洗滌菌體兩次，最后用MSM重懸，調節菌體濃度為1.0×109CFU·mL-1，作為種子液備用。將1%的菌株A-24接種到菊酯降解培養基中，在30℃、180 r·min-1條件下培養，每12 h取樣一次，測定培養液中氯氰菊酯的含量和菌株A-24的生長量（CFU·mL-1）。

1.6 不同碳源和氮源對菌株生長的影響

將菌株以2%接種量接種到100 mL基礎鹽培養基中，分別添加0.5%（V/m）的麥芽糖、糊精、蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉作為碳源，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養48 h，分別測定各樣品在OD600處的吸光值，每個處理3次重復。

將菌株以2%接種量接種到100 mL基礎鹽培養基中，分別添加0.5%（V/m）的尿素、硝酸鉀、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、亞硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨作為氮源，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養48 h，分別測定各樣品在OD600處的吸光值，每個處理3次重復。

1.7 菊酯降解特性研究

在菊酯降解培養基中，按2%接種量接入A-24菌株種子液，分別于20、25、30、35、42℃和45℃條件下，180 r·min-1搖床培養，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定溫度對菌株降解聯苯菊酯的影響。

在初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的MSM培養基中，加入20 mg·L-1的菊酯，按2%接種量接入菌株的種子液，于30℃、180 r·min-1搖床培養，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定pH對菌株降解菊酯的影響。設置空白對照。采用乙酸鈉緩沖液調節pH 5.0、6.0，磷酸鈉緩沖液調節pH 6.0～8.0，Tris-HCl緩沖液調節pH 8.0～10.0。

在添加氯氰菊酯終濃度分別為20、50、100 mg·L-1和150 mg·L-1的無機鹽培養基中，按2%接種量接入A-24菌株種子液，于30 ℃、180 r·min-1搖床培養，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解率的影響。對照是添加相應二甲基亞砜溶劑到無鹽培養基中，并在相同條件下培養。

在菊酯降解培養基中，分別按0.5%、1%、2%、5%和10%接種量接入A-24菌株種子液，于30℃、180 r·min-1搖床培養，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響。

1.8 氯氰菊酯含量測定及降解產物檢測

氯氰菊酯含量測定采用全量提取法：在20 mL培養基中加20 mL二氯甲烷，劇烈振蕩3 min后，靜置分層，取有機相經無水Na2SO4脫水，然后準確取1 mL有機相置于2 mL離心管中，并在通風柜內揮發后，重新定容到1 mL色譜純正己烷中，氣相色譜檢測氯氰菊酯濃度。氣相色譜檢測條件：ECD檢測器、SPB-5毛細管柱（30.0 mm×0.530 mm×1.5μm），進樣口溫度240℃，柱溫240℃，檢測器溫度310℃，載氣為氮氣，流速為1 mL·min-1[17]。

降解產物檢測采用全量提取法：準確取1 mL有機相置于2 mL離心管中，并在通風柜內揮發，最后定容到1 mL乙腈/水（60/40，V/V，用甲酸酸化pH為3.0）溶液中，采用高效液相色譜法對降解產物進行鑒定。高效液相色譜（HPLC）檢測條件：液相色譜柱為C18反相柱，規格250 mm×4.6 mm；流動相為乙腈∶水（60∶40，V∶V）；加入甲酸，pH調為3.0，柱溫為30 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm[17]。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從上海郊區某農藥廠附近采集植物樣品牛筋草，從其根莖中分離到1株降解氯氰菊酯的內生菌，命名為A-24。菌株A-24的菌落圓形隆起、奶油狀、邊緣整齊，其生理生化特征為：需氧，革蘭氏染色呈陰性，氧化酶、脲酶和過氧化氫酶呈陽性，硝酸還原酶和淀粉水解酶呈陰性。

通過引物27F和1492R對菌株A-24的16SrRNA進行擴增，獲得1398 bp的基因序列，將該序列提交到GenBank，登錄號為MK454541。將菌株A-24的16S rRNA基因序列在數據庫EzBilCloud中比對分析，結果顯示菌株A-24與Achromobacter屬親緣關系最近，其中與Achromobacter xylosoxidans NBRC 15126T相似性達99.00%，與Achromobacter marplatensis B2T相似性達98.76%。運用MEGA5.0軟件通過Neighbor-join?ing法對菌株A-24構建系統發育樹（圖1），結果表明，菌株A-24與菌株Achromobacter xylosoxidans NBRC 15126T位于同一分支。結合菌落形態特性、生理生化特征以及16SrRNA基因比對分析，菌株A-24初步鑒定為Achromobacter屬。

圖1 基于16SrRNA基因序列構建的菌株A-24系統發育樹Figure 1 Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining analysis based on 16SrRNA gene sequences of strain A-24 and related species

2.2 菌株A-24以氯氰菊酯為唯一碳源的降解和生長曲線

氯氰菊酯的含量和菌株A-24的生長量結果如圖2所示。菌株A-24在48 h內對20 mg·L-1氯氰菊酯的降解率為91.8%，72 h內完全降解氯氰菊酯。菌株A-24在降解氯氰菊酯的過程中能夠利用其作為唯一碳源生長，菌體生長在12 h前為延滯期，12～60 h為對數期，由最初1.32×107CFU·mL-1增加至 6.92×107CFU·mL-1。表明菌株A-24能夠降解氯氰菊酯，并能夠利用氯氰菊酯作為碳源和能源生長。

圖2 菌株A-24降解氯氰菊酯及其生長曲線Figure 2 The growth of stain A-24 and degradation of cypermethrin by A-24

2.3 不同碳源和氮源對菌株A-24生長的影響

各碳源對菌株A-24生長的影響結果如圖3A。培養基MSM中添加果糖時菌株A-24在OD600處的吸光值最高，麥芽糖其次，葡萄糖最低。

各氮源對菌株A-24生長的影響結果如圖3B。菌株A-24在OD600處的吸光值隨著時間的增加而增加，有機氮源牛肉膏、蛋白胨和酵母膏培養基中A-24的吸光值高于尿素培養基，無機氮源硝酸鉀、硝酸銨和硫酸銨培養基中的吸光值明顯高于亞硝酸鈉。

2.4 溫度和pH對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響

如圖4A所示，菌株A-24在30℃時對氯氰菊酯的降解率最高，在25～42℃范圍內，均能很好地降解氯氰菊酯，降解率均在75%以上；當溫度在20℃時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率在60%以下；當溫度在45℃時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率在40%以下。如圖4B所示，菌株A-24在pH為7時對氯氰菊酯的降解效果最好，且與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）；在pH 7～8的范圍內菌株A-24均能較好地降解氯氰菊酯；而當pH為5或10時，與其他pH值相比其降解能力明顯下降，且差異顯著（P＜0.05），降解率低于60%。

2.5 初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解的影響

如圖5所示，當初始氯氰菊酯濃度≤50 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解都在70%以上；初始濃度控制在100 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解低于45%，且與20、50 mg·L-1處理差異顯著（P＜0.05），表明隨著氯氰菊酯初始濃度的升高菌株A-24的降解率降低；當初始濃度為150 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯降解率為30.85%，表明菌株A-24可耐受高濃度的氯氰菊酯。其助劑二甲基亞砜對菌株A-24的生長沒有影響。

圖3 添加不同碳源和氮源對菌株A-24生長的影響Figure 3 Effect of adding different carbon and nitrogen sources on the growth of strain A-24

2.6 接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響

對不同接種量條件下氯氰菊酯的降解效率的檢測結果如圖6所示。當接種量為0.5%、1%和2%時，氯氰菊酯48 h降解率分別為38.7%、67.2%和91.8%；當接種量為5%時，氯氰菊酯48 h的降解率即可達到99.45%；當接種量為10%時，36 h氯氰菊酯全部降解。結果表明，接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯影響較大，隨著菌株A-24接種量的增大，氯氰菊酯的降解效率逐漸增大，兩者呈正相關關系。

3 討論

圖4 溫度和pH對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 4 Effects of temperature and pH on degradation of cypermethrin by strain A-24

圖5 初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 5 Effect of initial concentration on degradation of cypermethrin by strain A-24

植物內生菌可以提高土壤中污染物的降解性能，以減輕農藥對植物的毒害作用[12，18-20]。與動物不同，植物沒有體細胞免疫，對于環境中的微生物，植物體是一個相對開放的空間，所以幾乎所有的植物體內都含有內生菌[21]。污染物的降解過程是酶催化反應的過程，針對不同的污染物，微生物會分泌不同的酶參與反應，從而將復雜的農藥結構降解為簡單的結構[17，22-26]。馮發運[27]在植物小飛蓬體內分離出Crono?bactersp.植物內生菌XFP-gy，其5 d降解20 mg·L-1毒死蜱的降解率為69.59%，外加碳源的降解率可達98.0%。在韭菜體內分離出Sphingomonassp.植物內生菌HJY，其15 d內可代謝95.88%初始濃度為20 mg·L-1的毒死蜱，1%的外加葡萄糖可使其對毒死蜱的降解率提高到6 d 98.48%。劉爽[28]在看麥娘中分離篩選出降解菲的植物內生菌Pn2，經鑒定該菌株為Naxibactersp.，此內生菌72 h對初始濃度49.92 mg·L-1的菲降解率達98.78%。孫凱等[29]從小飛蓬和三葉草中分離篩選出能降解芘的內生細菌BJ03和BJ05，初步鑒定為Acinetobactersp.和Kocuriasp.，15 d 對 50 mg·L-1的芘降解率分別為65.0%和53.3%。封國君[30]分離到能降解二甲四氯的植物內生菌E41和E68，并研究了菌株的降解特性，鑒定了菌株降解二甲四氯的產物為4-氯-2-甲基苯酚。有關氯氰菊酯微生物降解菌已經有很多報道[17，31-33]，但植物內生氯氰菊酯降解菌鮮有報道。

圖6 接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 6 Effect of inoculation size on degradation of cypermethrin by strain A-24

本研究的結果表明碳源、氮源種類影響微生物的生長，雖然菌株A-24均能以葡萄糖、蔗糖、淀粉等為碳源生長，但在以果糖為碳源時，生長最快，以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏為氮源時生長較快，說明只有添加適當的外加碳源、氮源，才能保證細胞的正常生長。有關微生物降解氯氰菊酯代謝途徑的研究已經有報道。Wang等[17]推測了菌株JZ-1降解氯氰菊酯的途徑，其可生成二氯菊酸和3-苯氧基苯甲醛，3-苯氧基苯甲醛再轉化成3-苯氧基苯甲酸。為研究菌株A-24降解氯氰菊酯的代謝途徑，在氯氰菊酯降解過程中定時取樣，并利用HPLC檢測其代謝產物。與標準品對照并根據其他菌株降解氯氰菊酯的代謝途徑[17]，將產物鑒定為3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）。據此推測菌株A-24降解氯氰菊酯的途徑為：氯氰菊酯首先通過酯鍵水解生成二氯菊酸和3-苯氧基苯甲醛，在脫氫酶的作用下，3-苯氧基苯甲醛生成3-PBA，然后在雙加氧酶的作用下進一步降解（圖7）。

本研究結果表明，植物內生菌株A-24的生長與降解對初始氯氰菊酯濃度、溫度和pH的適應范圍較寬，適合用于田間復雜多變的自然環境中菊酯污染的修復。因此深入研究菌株A-24降解氯氰菊酯機理，以及生物修復適用性等問題將是我們下一步研究的重點內容，這對植物內生細菌-植物聯合修復有機污染具有現實指導意義。

4 結論

（1）從農藥廠附近牛筋草中篩選到1株能夠以氯氰菊酯為唯一碳源生長的高效降解菌A-24，革蘭氏染色鑒定為陰性菌，經16SrDNA測序鑒定為Achro?mobacter屬。

（2）在不同碳源、氮源條件下，菌株A-24的生長速率不同，以果糖為碳源時菌株A-24生長最快，麥芽糖其次，葡萄糖最慢。在有機氮源牛肉膏、蛋白胨、酵母膏培養基中A-24生長較快，其中無機氮源亞硝酸鈉中最慢。

（3）菌株A-24在30℃時對氯氰菊酯的降解率最高，在pH 7時對氯氰菊酯的降解效果最好。當初始氯氰菊酯濃度≤50 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率較高。隨著菌株A-24接種量的增大，氯氰菊酯的降解效率逐漸增大。

圖7 推測菌株A-24降解氯氰菊酯的途徑Figure 7 Proposed metabolic pathway of cypermethrin by strain A-24