原生質體紫外誘變選育高產抗菌脂肽菌株及其活性物質的研究

謝定剛， 叢麗娜， 李若凡， 趙 金， 何媛媛

大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，其突出的特征是能夠產生耐熱、抗逆的芽孢，在自然界分布非常廣泛。它可以產生多種抗菌物質，其中抗菌脂肽是通過非核糖體合成途徑產生的具有抗菌作用的脂肽類化合物[1-3]。由于其具有廣譜、高效、安全無毒、不易產生耐藥性，并可以被生物降解、不會導致殘留引起環境污染等優點，目前抗菌脂肽在食品和化妝品行業、醫藥行業、農業等相關領域的研究和應用得到了廣泛的重視[4-6]。

黃曲霉是日常生活中常見的病原真菌，易在谷類、豆類等糧食和堅果上生長，是糧油食品中最常見的霉菌之一。由于黃曲霉對生活環境要求不高，只需要有一點碳與氮就能生長繁殖，并產生致癌性很強的黃曲霉毒素，其對人體健康及畜牧業造成很大的威脅[7]。目前，在防治黃曲霉引起的糧食作物霉變主要以化學防腐劑為主[8]，但化學防腐劑引起的人體健康問題日漸突出，研究和開發新的天然防腐劑已成為當今急切的需求，而枯草芽孢桿菌所產抗菌脂肽中的桿菌霉素D組分是目前唯一從微生物中得到并且已經鑒定的具有抗黃曲霉毒性的活性物質[9-11]。因抗菌脂肽其對人體健康沒有造成影響，因此，桿菌霉素D是目前替代化學防腐劑的熱點研究物質[12]。

本研究所用的枯草芽孢桿菌是從大連海域海參腸道中分離獲得，其發酵產物中的抗菌脂肽對水產養殖動物致病菌如副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌及日常生活常見的黃曲霉具有顯著的抑制作用[13-15]。但從自然中分離出的野生菌株其抗菌脂肽產量較低，而對枯草芽孢桿菌采用原生質體紫外誘變育種的研究尚未見報道[16]。以原生質體作為紫外誘變育種材料，在沒有細胞壁的保護下，細胞對紫外線更為敏感，而且原生質體再生過程中有一個優存劣亡的自然篩選作用，代謝旺盛的原生質體得以再生，從而提高了正突變率[17,18]。所以本研究采用原生質體紫外誘變育種的手段篩選出高產抗菌脂肽的誘變菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1出發菌株和指示菌

出發菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)mutHS-301，由本實驗室自主分離保藏的菌株(GenBank 數據庫檢索號：GQ466597)。

指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血性弧菌(Vibroparachaemolyticus)和黃曲霉菌(Aspergillus flavus)均由本實驗室保存。

1.1.2培養基

LB培養基(g/L)：酵母浸粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。固體培養基添加17～18 g/L瓊脂粉。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 10.0，牛肉膏15.0，磷酸氫二鉀 5.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

再生培養基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉 5.0，牛肉膏 5.0，NaCl 5.0，六水氯化鎂 4.07，順丁烯二酸2.32，甘露醇 91.1，瓊脂粉17～18，pH 6.7，115 ℃滅菌30 min。

PDA培養基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂粉 17～18，自然pH，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3試劑

高滲溶液A：用0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制1 mol/L 的NaCl溶液，115 ℃滅菌30 min備用。

溶菌酶溶液：用無菌高滲溶液A配制不同濃度的溶菌酶溶液，過水系0.22 μm膜，于-20 ℃保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株mutHS-301生長曲線的測定

從LB菌種斜面上取一環出發菌株mutHS-301接種至裝有10 mL的LB液體培養基，在30 ℃，180 r/min搖床培養16 h ～18 h。按2%的接種量接種至裝有100 mL的LB液體培養基中，在30 ℃，180 r/min的條件下搖床培養，每間隔2 h取樣測定培養液的OD600值。

1.2.2原生質體的制備及條件優化

取對數生長中后期的細胞菌液于滅菌的離心管中，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，用高滲溶液洗滌2次，離心并收集細胞。采用單因素實驗法測定不同的溶菌酶濃度、酶解時間和酶解溫度條件下對原生質體形成率和再生率的影響。選擇最適酶解條件對收集的細胞進行酶解破壁，酶解后離心使原生質體沉淀，棄上清液。獲得的原生質體用高滲溶液洗滌2次并離心，最后定容于高滲緩沖液中，通過平板菌落計數法調整原生質體濃度為105CFU/mL。

原生質體形成率 =(A-B)/A×100%

原生質體再生率 =(C-B)/(A-B)×100%

式中，A為酶解前LB培養基上的菌落數；B為酶解后LB培養基上的菌落數；C為酶解后再生培養基上的菌落數。

1.2.3原生質體紫外誘變處理

取制備好的原生質體懸浮液10 mL，置于直徑為9 mm的無菌培養皿(內置磁棒)中，并在磁力攪拌下用紫外燈照射(功率15 W，照射距離30 cm)，照射時間分別為0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s，光恢復10 min。取不同照射時間的原生質體處理液，按10倍系列梯度稀釋后涂布在高滲再生培養基上，30 ℃條件下恒溫避光培養18 h～24 h。待長出菌落，進行活菌計數并計算原生質體紫外誘變的致死率。

原生質體致死率 =(D-E)/D×100%

式中，D為誘變處理前再生培養基上的菌落數；E為誘變處理后再生培養基上的菌落數。

1.2.4高產抗菌脂肽菌株篩選及其遺傳穩定性測定

將經誘變后在再生培養基上生長的單菌落接種在LB固體培養基上劃線，30 ℃培養12 h ～14 h。連續轉接3代培養后，各菌株分別接種到做好編號的試管發酵液中，于30 ℃，180 r/min發酵培養48 h，離心收集上清液，采用牛津杯法測定發酵上清液對指示菌的抑菌圈直徑大小。選取抑菌圈較大的誘變菌株進行傳代培養，固體平板上連續轉接培養9代，并進行隔代搖瓶液體發酵培養48 h，離心收集上清液，采用牛津杯法測定其對指示菌的抑菌圈直徑大小，并與出發菌株作比較。同時用稀鹽酸將上清液調至pH為2進行酸沉，離心收集沉淀物，再用甲醇抽提后過膜收集濾液，將濾液于40 ℃恒溫旋蒸得到抗菌脂肽提取物。最后計算該誘變菌株抗菌脂肽產量的變化。

1.2.5制備型硅膠板純化抗菌脂肽單組分及分析

以氯仿∶甲醇∶水∶氨水的比例為60∶30∶3∶3作為展開劑，利用薄層色譜法對抗菌脂肽提取物各組分進行初步鑒定，并采用制備型硅膠板(GF254)對抗菌脂肽提取物進行單組分分離純化。稱取適量抗菌脂肽提取物溶于1 mL甲醇中，用毛細管充分點樣于制備型硅膠板上，在層析缸中經展開劑展開后，分別刮取同行分離單組分斑點的硅膠，用甲醇對硅膠中的單組分進行抽提，離心收集上清液，旋干后溶于1 mL甲醇。采用RP-HPLC對單組分進行分析檢測，并測定各單組分對黃曲霉的抑制作用。

1.2.6抗菌脂肽提取物對黃曲霉菌菌絲生長的影響

分別取1mL不同濃度抗菌脂肽提取物加入到19 mL已融化并冷卻至50 ℃左右的PDA培養基中，充分混勻后倒入無菌的培養皿中，制成分別含抗菌脂肽終濃度為0.20 mg/mL、0.18 mg/mL、0.16 mg/mL、0.14 mg/mL、0.12 mg/mL、0.10 mg/mL和0.08 mg/mL的系列培養基平板，以加入等體積無菌水的PDA平板作為對照(A)。用直徑為9 mm打孔器沿外緣鉆取在PDA培養基上已培養約48 h的黃曲霉菌落塊，分別接種于上述已經凝固的含抗菌脂肽培養基平板中央，菌絲面朝下，置于37 ℃恒溫培養箱內培養。待A組霉菌菌絲長至平板邊緣，采用十字交叉法測量含肽培養基上的菌落直徑，與對照組比較計算出不同濃度處理對該黃曲霉菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率=[(對照組菌落直徑-含肽組菌落直徑)/對照組組菌落直徑]×100%

1.2.7抗菌脂肽提取物對黃曲霉孢子致死濃度的測定

分別取1mL不同濃度抗菌脂肽提取物加入到19mL已融化并冷卻至約50 ℃的PDA培養基中，充分混勻后倒入無菌的培養皿中，制成分別含抗菌脂肽終濃度為1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL和0.05 mg/mL的系列培養基平板，以加入等體積無菌水的PDA平板作為對照(a)。取100 μL濃度為104CFU/mL黃曲霉孢子液涂布于各濃度梯度培養皿中，于37 ℃下培養。培養至第8 d時，即對照組(a)培養皿霉菌長滿整個平板且產生大量孢子，以此時無霉菌生長的最小濃度培養皿為最小致死濃度。

2 結果與討論

2.1 菌株mutHS-301生長曲線

本實驗采用分光光度法對枯草芽孢桿菌mutHS-301生長曲線進行測定。通過圖1可以看出菌株的生長經歷了延滯期、對數生長期、穩定期幾個階段。對數生長期大概在培養時間為2 h～14 h之間，此時期的菌體繁殖迅速，DNA復制頻繁，菌株生長代謝較為旺盛及細胞壁對破壁酶較為敏感，形成的原生質體對紫外線等物理因子的刺激較為敏感且較為容易長出細胞壁而得到再生，所以本實驗選擇處于對數中后期10 h的菌株作為研究對象。這樣既保證誘變實驗時健壯的菌體細胞足夠多以增加變異細胞的細胞總數，又可以減少分離性表型延遲現象的發生，從而使得誘變結果突變率較高且重現性較好。

圖1 枯草芽孢桿菌mutHS-301生長曲線

2.2 原生質體的制備和再生

(1)酶解時間對原生質體形成率和再生率的影響。以溶菌酶濃度為0.5 mg/mL，酶解溫度為37 ℃，測定酶解時間對原生質體制備的影響。由表1可知，在10 min ～30 min范圍內，原生質體形成率隨著酶解時間的延長而增加，而原生質體再生率則呈現先上升后下降趨勢。酶解時間為15 min時，原生質體形成率為98.23%，再生率達到31.51%。

(2)溶菌酶濃度對原生質體形成率和再生率的影響。由表1可知，隨著酶解濃度的增加，原生質體的形成率不斷提高，而再生率則呈現先上升后下降趨勢。酶解濃度為0.5 mg/mL時，原生質體形成率為97.85%，再生率達到31.83%。

(3)酶解溫度對原生質體形成率和再生率的影響。由表1可知，隨著酶解溫度的升高，原生質體的形成率不斷提高，而再生率則呈現先上升后下降的趨勢。酶解溫度為37 ℃時，原生質體形成率為98.12%，再生率達到29.94%。

表1 原生質體制備的條件優化

2.3 紫外誘變致死率曲線

對枯草芽孢桿菌mutHS-301的原生質體進行不同時間紫外照射，并計算出原生質體致死率(圖2)?？梢钥闯?，照射時間為20 s時，致死率為47.3%，隨著照射時間的延長，致死率也跟著升高，當照射時間為100 s時，致死率接近100%。高致死率往往伴隨著高突變率，能夠起到篩選出高產菌株的目的。近年來有傾向于致死率在80%～90%的誘變劑量的誘變效果較好，其正突變率較高[19]。故本實驗中紫外線照射時間選擇為60 s，其致死率為88.6%。

2.4 高產抗菌脂肽突變菌株的篩選

經紫外誘變獲得的突變菌株進行初篩和復篩，得到6株對指示菌抑菌圈有明顯提高的菌株，分別命名為mutHS-501、mutHS-530、mutHS-539、mutHS-561、mutHS-580和mutHS-596。結果如圖3所示。

圖2 枯草芽孢桿菌mutHS-301致死率曲線

圖3 誘變菌株篩選結果

由圖3可以看出，6株突變菌株對指示菌抑菌直徑較出發菌株mutHS-301有明顯提高，其中mutHS-539對副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌抑菌直徑較mutHS-301分別提高了21.49%和21.05%。

2.5 高產抗菌脂肽菌株遺傳穩定性研究

將復篩得到的高產抗菌脂肽突變菌株進行遺傳穩定性測定，經傳9代后，并通過隔代發酵測定突變菌株產抗菌脂肽的量的變化。實驗發現，突變株mutHS-539產抗菌脂肽的量最高，其產量較出發菌株mutHS-301提高了40%左右，而且它的產量波動較小，并在誤差范圍內無明顯差異(圖4)。由此可以看出，菌株mutHS-539是一株遺傳性狀十分穩定的突變菌株。

圖4 誘變菌株mutHS-539的遺傳穩定性

2.6 抗菌脂肽單組分的分離及對黃曲霉抑菌活性檢測

通過TLC點板，發現獲得的突變株mutHS-539發酵提取物主要含有4種組分(圖5A)，分別為a、b、c和d，其RT值相應為0.83、0.74、0.56、0.28。利用制備型硅膠板對各個組分進行分離純化，并對黃曲霉進行抑菌活性測定。發現獲得的4種組分中只有組分d對黃曲霉有明顯的抑制作用(圖5B)。并經高效液相RP-HPLC檢測，發現組分d中有3組主峰存在，通過已測定的液質聯用數據對比，發現1、2和3號峰物質相對分子量分別為1 031.54、1 045.56和1 059.57，它們是抗菌脂肽Iturin家族桿菌霉素Bacillomycin D的C14、C15和C16同系物(圖6)[15]。另外，根據峰面積歸一化法可求得組分d中的桿菌霉素D含量達到95%以上。結果表明，枯草芽孢桿菌代謝產物抗菌脂肽中只有桿菌霉素D成分對黃曲霉有顯著的抑制作用。

圖5 抗菌脂肽單組分分離純化及對黃曲霉抑菌作用

圖6 組分d高效液相色譜圖

2.7 抗菌脂肽提取物對黃曲霉菌菌絲生長的影響

抗菌脂肽提取物對黃曲霉菌菌絲生長的抑制作用如圖7所示。采用十字交叉法測量含肽培養基上的菌落直徑，結果如表2所示。研究發現隨著抗菌脂肽濃度的提高，抑制作用越來越明顯。當抗菌脂肽的濃度為0.14 mg/mL時，其對黃曲霉菌菌絲生長的抑制率超過了50%，而當抗菌脂肽的濃度達到0.20 mg/mL時，其對黃曲霉菌菌絲生長的抑制率達到了74.22%，這說明抗菌脂肽提取物對黃曲霉的菌絲生長具有較強的抑制作用。

抗菌脂肽濃度/(mg·mL-1)：A.0；B.0.08；C.0.10；D.0.12；E.0.14；F.0.16；G.0.18；H.0.20

表2 抗菌脂肽對黃曲霉菌菌絲的抑制率

2.8 抗菌脂肽提取物對黃曲霉孢子致死濃度的測定

以平板法測定抗菌脂肽提取物對黃曲霉孢子的致死濃度。結果如圖8所示，培養至第8 d時，對照組(a)培養皿中有明顯的霉菌生長且產生孢子，此時抗菌脂肽濃度為0.8 mg/mL的平板未發現有霉菌生長，即抗菌脂肽提取物對黃曲霉孢子的致死濃度為0.8 mg/mL。

抗菌脂肽濃度/(mg·mL-1)：a.0；b.0.05；c.0.1；d.0.2；e.0.4；f.0.6；g.0.8；h.1.0

3 結論

采用紫外誘變方法對枯草芽孢桿菌mutHS-301的原生質體進行誘變，通過篩選獲得一株性狀良好的突變菌株mutHS-539，其在抑制病原指示菌及抗菌脂肽產量上較出發菌株均有顯著提高。進一步對其所產的抗菌脂肽提取物進行單組分分離純化，獲得的4種組分中只有組分d對黃曲霉有顯著的抑制作用，經數據對比和分析，發現該組分為桿菌霉素D。本文的研究為今后將其開發為天然防腐劑奠定理論基礎。