核因子κB 和膽固醇調節原件結合蛋白2 在原發性肝癌組織中的表達及與患者臨床特征和預后的關系

張蓓，答秀維，張樂，蘭飛

空軍軍醫大學第二附屬醫院唐都醫院1疼痛科，2腫瘤科，西安7100380

原發性肝癌是臨床中常見的惡性腫瘤之一，發病率及病死率極高，嚴重威脅人類的生命健康。原發性肝癌的病因及發病機制尚未明確，目前認為其與病毒性肝炎、肝硬化、遺傳等因素有關[1-3]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是細胞內重要的轉錄因子，可在第一時間對有害細胞的刺激做出反應，調控基因轉錄[4-5]。膽固醇調節原件結合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）是位于內質網膜上的二次跨膜蛋白，可促進機體代謝，調控膽固醇合成[6]。研究表明，NFκB、SREBP2 與多種腫瘤的生存、增殖、轉移、黏附和侵襲密切相關[7]。本研究探討了原發性肝癌組織中NF-κB 和SREBP2 的表達情況，并分析其與患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015 年1 月至2017 年1 月空軍軍醫大學第二附屬醫院唐都醫院收治的原發性肝癌患者。納入標準：①經手術或穿刺活檢病理確診為原發性肝癌；②生存時間＞6 個月；③臨床資料完整；④TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并器官衰竭等嚴重疾??；③出現遠處轉移；④術前已進行化療或放療。依據納入和排除標準，本研究共納入74 例患者。74 例患者中，男42 例，女32 例；年齡31～72 歲，平均年齡（58.41±3.58）歲；腫瘤數目：單發62 例，多發12 例；病理類型：肝細胞癌50 例，其他24 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ期24 例。收集74 例原發性肝癌患者的原發性肝癌組織74 例和癌旁正常組織（距離腫瘤組織邊緣＞3 cm）46 例。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase）法進行免疫組織化學染色。將肝癌組織和癌旁正常組織標本經常規石蠟切片、脫水后，加入100%、95%、85%梯度乙醇各5 min，自來水沖洗。將切片置于3%過氧化氫溶液-甲醇中，室溫靜置10 min，蒸餾水沖洗3 min，采用pH 9.0 的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）緩沖液煮沸20 min 進行抗原修復，加入一抗（1∶70）室溫放置2 h。顯色劑顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察NF-κB、SREBP2 的表達情況，檢測過程嚴格按照說明書進行。Elecsys2010 電化學發光分析儀及相關試劑均購自羅氏公司。

1.3 評分標準

由2 位高年資病理醫師采用雙盲法進行閱片。NF-κB、SREBP2 陽性顆粒位于細胞質或細胞核中，呈棕黃色或棕褐色[8]。染色強度評分：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 份，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：＜26%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘，0～1 分為陰性（-），2～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中等陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。陽性表達率=陽性例數/總例數×100%。

1.4 隨訪

治療結束后，以電話隨訪及門診復診的方式對74 例原發性肝癌患者進行2 年隨訪，詳細記錄兩組患者治療后的總生存時間（即患者開始治療至隨訪截止或患者死亡的時間）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；采用Cox 回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原發性肝癌組織和癌旁正常組織中NF-κB、SREBP2 表達情況的比較

原發性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽性表達率分別為71.62%（53/74）和68.92%（51/74），分別高于癌旁正常組織的50.00%（23/46）和47.83%（22/46），差異均有統計學意義（χ2=5.711，P=0.017；χ2=5.297，P=0.021）。

2.2 不同臨床特征原發性肝癌患者原發性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑的原發性肝癌患者原發性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌的原發性肝癌患者原發性肝癌組織中NF-κB 的陽性表達率分別高于中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯、無淋巴結轉移、其他病理類型的患者，差異均有統計學意義（χ2=8.385、25.620、15.661、11.605、10.245，P＜0.05）。低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌的原發性肝癌患者原發性肝癌組織中SREBP2 的陽性表達率分別高于中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯、無淋巴結轉移、其他病理類型的患者，差異均有統計學意義（χ2=4.894、8.837、10.956、11.663、8.581，P ＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征原發性肝癌患者原發性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的表達情況

2.3 生存情況的比較

NF-κB 陰性表達和NF-κB 陽性表達患者的平均生存時間分別為（30.43±6.23）個月和（22.25±5.24）個月，SREBP2 陰性表達和SREBP2 陽性表達患者的平均生存時間分別為（30.17±7.34）個月和（22.37±5.81）個月。生存分析顯示，NF-κB 陰性表達患者的生存情況優于NF-κB 陽性表達患者，差異有統計學意義（χ2=4.431，P=0.035）；SREBP2 陰性表達患者的生存情況優于SREBP2 陽性表達患者，差異有統計學意義（χ2=4.889，P=0.028）。（圖1、圖2）

2.4 原發性肝癌患者預后影響因素的單因素分析

圖1 NF-κB陰性表達（n=21）和NF-κB陽性表達（n=53）原發性肝癌患者的生存曲線

圖2 SREBP2陰性表達（n=23）和SREBP2陽性表達（n=51）原發性肝癌患者的生存曲線

不同性別、年齡、腫瘤直徑原發性肝癌患者的2 年生存率比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。NF-κB 陰性表達、SREBP2 陰性表達、中/高分化、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯、無淋巴結轉移、病理類型為其他的原發性肝癌患者的2 年生存率分別高于NF-κB 陽性表達、SREBP2 陽性表達、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌的原發性肝癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.5 原發性肝癌患者預后影響因素的多因素Cox回歸分析

以單因素分析中差異有統計學意義的因素作為自變量，以患者預后作為因變量進行Cox 回歸分析，結果顯示，NF-κB 陽性、SREBP2 陽性、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌均是原發性肝癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表3）

2.6 NF-κB 與SREBP2 表達的關系

NF-κB 陰性原發性肝癌患者原發性肝癌組織中SREBP2 的陽性表達率為33.33%（7/21），明顯低于NF-κB 陽性患者的83.02%（44/53），差異有統計學意義（χ2=17.334，P＜0.01）。（表4）

3 討論

原發性肝癌具有侵襲性強、易復發、易轉移等生物學特性，盡管現代診療技術不斷發展，仍無法改變患者確診時間晚、治療后復發率高、遠期療效差的現狀。越來越多的研究表明，NF-κB 和SREBP2 與腫瘤的發生具有密切關系[8-9]。研究報道，乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌、大腸癌中NF-κB 和SREBP2 均有陽性表達[10]。

表2 原發性肝癌患者預后影響因素的單因素分析（n=74）

表3 原發性肝癌患者預后影響因素的多因素Cox 回歸分析（n=74）

表4 NF-κB 與SREBP2 表達的關系

NF-κB 是近年來發現的重要轉錄因子之一，廣泛存在于哺乳動物中，可與B 淋巴細胞免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB 序列特異性結合。研究發現，活化的NF-κB 能夠上調細胞間黏附因子的表達，參與腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移[11-12]。SREBP2 是一種調控膽固醇合成的關鍵限速酶，有學者發現，沉默SREBP2 可有效減少細胞內膽固醇的聚集[13]。本研究結果顯示，原發性肝癌組織中NF-κB、SREBP2 的陽性表達率均高于癌旁正常組織（P＜0.05）；且NF-κB、SREBP2 陽性表達患者的2 年生存率分別低于NF-κB、SREBP2 陰性表達的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明NFκB 和SREBP2 在原發性肝癌患者中陽性表達，可能是作為癌基因參與原發性肝癌的發生、發展，這一研究結果與既往文獻報道的結果一致[14]。

本研究結果顯示，低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌的原發性肝癌患者原發性肝癌組織中NF-κB 和SREBP2 的陽性表達率分別高于中/高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無脈管侵犯、無淋巴結轉移、其他病理類型的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），與李曉楓和劉展華[15]報道的結果一致。本研究分析了NF-κB、SREBP2 表達情況與原發性肝癌患者預后的關系，結果發現，NF-κB、SREBP2 陰性表達患者的生存情況分別優于NF-κB、SREBP2 陽性表達的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示NF-κB、SREBP2 與原發性肝癌患者的預后具有密切聯系。分析其原因可能是細胞受到外源刺激后，活化的NF-κB 和SREBP2 進入細胞核內，發揮其功能。本研究的Cox 回歸分析結果顯示，NF-κB陽性、SREBP2 陽性、低分化、TNM 分期為Ⅲ期、有脈管侵犯、有淋巴結轉移、病理類型為肝細胞癌均是原發性肝癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。再次證實了NF-κB、SREBP2 在原發性肝癌發生、發展及預后評估中的價值。本研究結果還顯示，NF-κB 陰性原發性肝癌患者原發性肝癌組織中SREBP2 的陽性表達率為33.33%（7/21），明顯低于NF-κB 陽性患者的83.02%（44/53），差異有統計學 意 義（χ2=17.334，P ＜0.01）。提 示NF-κB 與SREBP2 的表達密切相關，表明SREBP2 可能通過NF-κB 的激活參與原發性肝癌的發生、發展，但其機制有待進一步研究。

綜上所述，NF-κB 和SREBP2 在原發性肝癌組織中的陽性表達率較高，NF-κB 和SREBP2 陽性表達患者多合并脈管侵犯、低分化、高TNM 分期及淋巴結轉移等特征，NF-κB 和SREBP2 陽性表達的原發性肝癌患者的預后較差。臨床中檢測NF-κB 和SREBP2 的表達情況對監測原發性肝癌患者病情、腫瘤轉移及評估預后具有重要意義。