龍山地區干豆豉真菌多樣性研究

倪慧，王玉榮，尚雪嬌，張振東，周書楠，郭壯

（湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053）

豆豉，古稱“嗜”或“幽菽”，是以黃豆或黑豆為主料，添加食鹽、辣椒和白酒等發酵而成的一種傳統特色調味制品[1]。豆豉中含有的血管緊張素轉化酶抑制肽和酶提取物等具有降血壓[2]、溶血栓[3]以及預防和治療過敏性皮炎等功效[4]。我國各地一直以來都有制作和食用豆豉的習慣，不同地區制作豆豉的工藝不同，成品種類繁多，根據含水量多少或體態可將其分為干豆豉、豆豉和水豆豉，其中干豆豉是指將發酵完成的豆豉進行干燥使水分降低至35%以下的產品[5]。

除富含乳酸桿菌、乳酸球菌、葡萄球菌和芽孢桿菌等細菌外[6-7]，豆豉中富含的酵母和霉菌等真菌對產品風味品質的形成亦有著積極的作用[8]，因而對豆豉中真菌微生物多樣性進行解析是極為必要的。柳陳堅等采用焦磷酸高通量測序發現云南普洱市豆豉中的真菌均為假絲酵母屬（Candida）[9]；Zhang W 等采用 Illumina MiSeq 分析發現甘肅地區豆豉中的真菌有畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）和亞羅酵母屬（Yarrowia）[10]；Lin Y 等采用同樣的方法研究江西豆豉發酵過程中的真菌變化，發現其優勢真菌屬為曲霉（Aspergillus）和立克次霉屬（Lichtheimia）[11]；任璐等從永川和三臺毛霉型豆豉中分離出產β－葡萄糖苷酶、纖維素酶和蛋白酶能力不同的 2 株總狀毛霉（Mucorracemosus racemosus）[12]。上述研究的開展，均表明豆豉中存在著豐富的真菌類群。

龍山縣位于湖南省湘西土家苗族自治州北部，區位獨特，具有較為獨特的飲食習俗[13]。本研究以采集自湘西州龍山縣傳統發酵干豆豉為研究對象，采用第二代高通量測序技術對其中真菌群落結構組成進行分析，以期為當地傳統發酵食品中菌種資源發掘及應用提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

干豆豉：于2018 年12 月采集自湖南省湘西土家苗族自治州龍山縣中街農貿市場市場、民安鎮農貿市場和步行街農貿市場，編號依次為LS1～LS5；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒：德國 QIAGEN 公司；FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、5×Trans StartTM、FastPfu Buffer、5×PCR Buffer：北京全式金生物技術有限公司；DNA 1000 試劑盒：美國Agilent 公司；6×Lodding Buffer：天一輝遠生物科技有限公司；111860 瓊脂糖：香港基因有限公司。

ND-2000C 微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；5810R 臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf 公司；VeritiTM96 孔梯度PCR 擴增儀：美國AB 公司；PowerPacTMBasic 穩壓儀、DCodeTMSystem、UVPCDS-8000 凝膠成像分析系統：美國BIO-RAD 公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq PE300 高通量測序平臺：美國Illumina 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 干豆豉樣品采集及前處理

樣品采集后分裝在50 mL 無菌離心管中置于-80 ℃條件下備用。

1.2.2 樣品微生物基因組DNA 提取

干豆豉樣品微生物基因組DNA 的提取方法參照DNA 基因組提取試劑盒說明書中的操作步驟進行，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）和微量紫外分光光度計對提取的DNA 的純度和濃度進行檢測，合格的DNA 存于-20 ℃備用。

1.2.3 真菌18S rDNA 擴增與測序

正向和反向引物分別為SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和 SSU1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）且在正向引物中加入核苷酸標簽（Barcode）。擴增體系及程序參照胥偉等[14]和陳慶金等[15]的方法進行操作：20 μL 的擴增體系中有DNA 模板 10 ng，5×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，5 μmol/L SSU0817F 和 SSU1196R 各 0.8 μL，5 U/μL DNA 聚合酶 0.4 μL 以及無菌無酶超純水12 μL，將體系混勻后進行擴增。擴增第一步：95 ℃預變性 3 min；第二步：95 ℃變性 30 s，55 ℃復性 30 s，72 ℃延伸 45 s；第三步：72 ℃維持 10 min 以使 DNA 鏈完全延伸，其中，第二個步驟需循環30 次。擴增產物鑒定合格且純化后寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.3 數據處理與分析

將兩條成對序列（reads）進行拼接，然后參照文獻[16]中的方法對拼接后的序列進行質控和篩選。以Barcode 為參照將各reads 劃分到不同樣品中，切除Barcode 和引物，過濾短序列。利用QIIME[17]分析平臺對樣品中微生物多樣性進行分析，用UCLUST 軟件[18]將相似度不小于97%的序列劃分至同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）中，然后從每個OTU 中挑選代表性序列使用SILVA 數據庫[19]進行物種注釋。樣品真菌豐度和多樣性以超1 指數、發現物種數和香農指數等指表進行評估。在本研究中將樣品中平均相對含量大于1.0%的真菌門或屬定義為優勢真菌們或屬，將平均含量小于1%的真菌門或屬歸類于“其他的”。

利用Origin2017 和Excel 對測序結果進行統計，并繪制折線圖分析測序深度。韋恩圖（Veen）使用Veeny2.1.0 在線繪制（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）用于顯示個樣品間特有和共有的OTU 數。

2 結果與分析

2.1 測定結果統計

本研究首先以香農指數和發現物種數為參照對測序條件及深度進行評估，結果如圖1 所示。

圖1 香農指數曲線和稀疏曲線Fig.1 The map of Shannon index curve and rarefaction curve

由圖1 可知，隨著測序量的增加，香農指數逐漸增大，說明測序量越大，樣品中真菌豐富度越高。與之不同的是，當測序量大到7 500 條左右時稀釋曲線已逐漸趨于平穩，表明測序量足夠，樣品中的真菌已基本全部被覆蓋。本研究從5 個傳統發酵干豆豉樣品中共檢測出82 541 條（100%相似度）有效序列，測序深度合理，可用于進一步分析。

作為反映生態學中生物多樣性的重要指標之一，超1 指數、香農指數和辛普森指數等Alpha 多樣性指數常用于顯示某一特定區域或生態系統內生物的均勻度和豐富度。各樣品中檢測出的序列數、OTU 數、超1 指數和香農指數值如表1 所示。

表1 樣品真菌測序概況Table 1 Statistics analysis of sample fungal sequencing results

由表 2 可知，LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 測得有效序列數分別為 43 848、55 757、44 191、53 906 和 44 293條，OTU 數分別為 1 080、1 512、1 525、1 636 和 1 361個。香農指數的值是 LS4＞LS3＞LS5＞LS2＞LS1，說明在所有樣品中LS4 中真菌多樣性最高，LS1 最低。超1 指數的值是 LS3＞LS5＞LS2＞LS1＞LS4，說明 LS3 中真菌豐富度最高，LS4 最低。香農指數和超1 指數的平均值分別為5.51±0.76 和4 128±332，表明龍山干豆豉中含有較為豐富的真菌菌群，且不同樣品間的數目和均勻度都存在一定差異。

2.2 樣品真菌OTU分析

納入本研究的樣品中檢測出的82 541 條高質量序列在97%的相似水平下可歸并至5 501 個OTU 中，各樣品中獨有或樣品間共有的OTU 數如圖2 所示。

圖2 干豆豉中共有和獨有OTU 分析Fig.2 Common and unique OTU analysis in dried douchi

由圖2 可知，Veen 圖重疊部分較多，各樣品間存在復雜的數目不等的OTU 數，LS1～LS5 中獨有的OTU數分別為 705、754、776、960 和 1 051 個，而 5 個樣品中共有的OTU 數僅為113 個，但其所包含的序列數占總序列數的64.68%。這表明樣品間真菌種類和數量存在較大差異但共有的真菌數量較多。這與譚強來等[20]研究的江西豆豉中的真菌OTU8 個，真菌種類較單一的結論存在一定差異。這可能是由于其采集的樣品來源于食品公司，是經工業化生產而來，生產環境要比農戶自制嚴格，從而降低了外界真菌進入產品中的可能性。

本研究進一步對核心優勢OTU 在各樣品中的分布情況進行統計，結果如圖3 所示。

圖3 核心優勢OTU 在各樣品中的相對含量Fig.3 The relative content of core dominant OTU in each sample

由圖3 可知，在各樣品中均存在且相對含量大于1.0%的OTU 即核心優勢OTU 有9 個，這些OTU 在不同樣品中的分布不同。在所有樣品中LS1 中OTU3388的相對含量最高，OTU3018 的相對含量最低；OTU1774在LS2 和LS3 中的相對含量也要明顯高于其他樣品，值得注意的是LS5 中核心優勢OTU 的累積相對含量要明顯低于這些OTU 在其他樣品中的比例。這與圖2分析結果一致，即LS5 中獨有OTU 數要高于其他樣品。進一步對核心OUT 間的相關性進行分析，結果如圖4 所示。

圖4 核心OUT 相關性分析Fig.4 The correlation analysis of core OUTs

由圖4 左側和上方的聚類分析可知，樣品中的9 個核心 OTU 可分為 3 個聚類，OTU3658 和 OTU5393 為一類，OTU978、OTU84、OTU1774 和 OTU3018 為一類，OTU3388、OTU93 和OTU1664 為一類。從熱圖中可以看出，OTU84 與 OTU3018 呈顯著正相關（p<0.05），與OTU978 呈極顯著正相關（p<0.001），與 OTU1774 相關性非常顯著 （p<0.001）；OTU3018 與 OTU978 和OTU1774 的相關性均非常顯著（p<0.01）；OTU1664 與OTU33888 呈顯著正相關（p<0.05），OTU93 與 OTU3388相關性非常顯著（p<0.01）；OTU978 與 OTU1774 相關性非常顯著（p<0.01）；OTU5193 與 OTU3658 呈顯著正相關（p<0.05）。整體而言，各核心OTU 間相關性明顯，且主要呈現正相關關系。

2.3 物種注釋

使用SILVA 數據庫對從每個OTU 中挑選的代表性序列進行物種注釋并對其微生物學分類地位進行統計，發現龍山干豆豉樣品中真菌門、綱、目、科和屬的數量分別為 7、13、22、26 和 31 個，各樣品中優勢真菌門信息如圖5 所示。

圖5 不同樣品中各優勢真菌門相對含量Fig.5 Relative content of dominant fungal phyla in different samples

LS1、LS2、LS3、LS4 和 LS5 中真菌門的數量分別為3、6、4、4 和 3 個，所鑒定出的真菌門有 Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota、Zoopagomycota （捕蟲霉門）、Chytridiomycota（壺菌門）和 Nucletmycea（無對應中文名），其中Chytridiomycota 和Nucletmycea 均只在LS2 中被檢測出且相對含量較低，僅為0.003 %和0.002 %。由圖 5 可知，Ascomycota、Basidiomycota 和Mucoromycota 的龍山干豆豉中的核心優勢真菌門，三者累積平均相對含量高達96.32%。各優勢真菌門在各樣品中的含量存在差異，Mucoromycota 在LS3 中的相對含量為5.68 %，而在LS5 中的相對含量僅為0.01%。進一步對各樣品中真菌屬進行分析，結果如圖6 所示。

圖6 干豆豉中優勢真菌屬相對含量Fig.6 Relative content of dominant fungi genera in dried douchi

由圖6 可知，龍山干豆豉中的優勢真菌屬及其平均相對含量分別為 Aspergillus（26.17 %）、Candida（12.77 %）、Trichosporon（10.40 %）、Pichia（8.56 %）、Kluyveromyces（6.56%）、Yamadazyma（5.50%）、Cryptococcus（隱球酵母屬，4.76%）、Galactomyces（耐堿酵母屬，3.68%）、Cladosporium（枝孢屬，2.26%）、Wallemia（節擔菌屬，2.24%）和 Rhizopus（米根霉屬，1.20%）。其中，在LS1 中未檢測到Cryptococcus 和Wallemia，LS3中未檢測到Cryptococcus，LS4 中未檢測到Cryptococcus 和 Cladosporium。Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和Rhizopus 作為核心優勢真菌存在于所有樣品中，且并未發現占絕對優勢的真菌屬。結合圖4 可知各核心真菌間相互作用，共同形成龍山干豆豉獨特品質。此外，所有樣品中有14.34%的序列不能鑒定到屬水平，表明該地干豆豉中仍有大量的真菌資源未被發掘。

3 結論

本研究中，從龍山干豆豉中檢測出有效真菌序列82541條，劃分的OTU 數為5501個。各樣品中核心優勢真菌門極其平均相對含量分別為Ascomycota（73.01%）、Basidiomycota（20.42 %）和 Mucoromycota（2.89 %），在發現的54 個真菌屬中有8 個為核心優勢真菌屬：Aspergillus、Candida、Trichosporon、Pichia、Kluyveromyces、Yamadazyma、Galactomyces 和 Rhizopus。由此可見，龍山干豆豉中真菌多樣性較高，后續研究中采用純培養技術對其中蘊含的菌株進行挖掘保護，同時積極開展相關菌株的應用研究極為必要。