超聲輔助糖基化改性玉米醇溶蛋白結構和機械性能的影響

郭浩，張慧君，陳又銘，李萍，王一正

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術研究中心，黑龍江齊齊哈爾161006）

有些天然植物蛋白因其特殊的氨基酸組成，通常被認為不完全蛋白，且不能滿足食品體系或者加工的需求，因此需要對這類蛋白質進行改性。蛋白質改性的實質是切斷蛋白質分子中肽鏈上的基團，再經過聚合反應或引入新的基團來進行修飾，使其分子結構發生特定的結構變化，從而造成蛋白空間結構和理化性質改變，使蛋白功能特性得到改善[1]。

玉米醇溶蛋白（zein）是玉米濕法加工淀粉副產物——玉米黃粉中的主要蛋白質，它含有較多的非極性氨基酸和較少的極性氨基酸，這些氨基酸分子間在二硫鍵、疏水鍵和氫鍵的作用下連接在一起，具有良好的成膜特性[2]。然而由純玉米醇溶蛋白制成的膜材質較脆，機械性能差，限制了在食品及其它領域的應用。

加入塑化劑是一種提高膜機械性能的蛋白質化學改性的常用方法[3-5]，但是存在如改性操作條件苛刻，化學試劑殘留、形成有毒的氨基酸衍生物和改變營養價值等弊端[6-8]。糖基化改性是食品加工和保藏的一種常見方法，是將蛋白質分子中氨基酸側鏈的自由氨基與糖分子還原末端的羰基之間的羧氨反應[9]，主要有干熱法和濕熱法兩種方式[10-14]。其中干法就是利用蛋白質和多糖發生美拉德反應，通過調節反應時間和溫度等條件，使糖基化反應控制在初級階段，褐變程度低。干熱法雖然較濕熱法反應時間長，條件苛刻，但是可使蛋白質的氨基保持非聚集狀態，且反應溫度低于蛋白質的變性溫度，反應生成物功能性好，而且由于多糖僅有一個還原末端，與蛋白質反應也比較簡單。

由于玉米醇溶蛋白不溶于水，易溶于60%～95%的乙醇溶液中，而多糖在乙醇溶液中形成沉淀，因此在干法糖基化反應時，氨基供體和羰基供體不能很好相容。利用超聲可以解決還原多糖在玉米醇溶蛋白的醇溶液中的分散性。另外當超聲作用于介質中，會發生周期性壓縮和擴張作用的疏密振動波，在不斷變換壓縮和擴張的過程中，超聲波就會產生近于真空或含少量氣體的空穴（氣泡）?？昭ń浂啻沃芷谡袷幾罱K迅速破裂，同時產生高強度的剪切力打斷蛋白質肽鏈之間的化學鍵，破壞了蛋白分子間或分子內化學鍵間的緊密聯系，使蛋白質內的氨基酸基團暴露，進而使糖基化反應的化學位點暴露出來，提高糖基化反應程度[15-16]。另一方面，玉米醇溶蛋白中二級結構是氨基酸殘基在肽鏈中通過二硫鍵、疏水鍵和氫鍵連接在一起的構象，包含α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲。隨著超聲功率的增加使超聲波逐漸產生強烈的剪切作用和空化效應，并轉化為機械能、熱能，破壞蛋白質肽鏈上的肽鍵，促進糖基化改性反應，提高改性后產物的機械性能[17-20]。

近年來，超聲波技術對蛋白質改性方面研究越來越吸引學者的關注。朱建華[21]研究了超聲波處理對大豆分離蛋白溶解性的影響，結果表明大豆分離蛋白溶液經不同功率的超聲處理后溶解度隨超聲功率的增大而增大。王喜波等[22]采用超聲技術輔助琥珀?；男源蠖沟鞍?，測得改性產物乳化活性和乳化穩定性分別比未改性樣品提高了94.5%和268.9%。趙璞等[23]利用超聲波技術對牛乳中含量最多的酪蛋白進行改性，測定其功能特性，結果表明隨著超聲處理中時間和功率的增加，酪蛋白功能性質中溶解性、乳化性以及乳化穩定性都有不同程度的提高。

本研究采用菊粉（inulin）作為還原糖的供體，它是由果糖分子通過β（2-1）鍵連接，末端含有一個葡萄糖分子的高分子化合物，是聚合度DP ＞10 以上，純度為95%的多聚果糖?？疾煊衩状既艿鞍自诔曒o助改性過程中玉米醇溶蛋白的結構變化，探索其與提高膜機械性能的作用之間的關系，為玉米醇溶蛋白的糖基化改性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉：黑龍江省鏡泊湖農業開發股份有限公司；菊粉：大連佐源生物工程科技有限公司；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）：天津光復精細化工研究所；Tris、甘氨酸：生物生工（上海）工程股份有限公司；5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸 （5，5-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、鹽酸胍、尿素：上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇、巰基乙醇、無水乙醇（分析純）：天津市天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

超聲波信號發生器（WSL-1000D）：南京順流儀器有限公司（變幅桿為Φ6）；真空冷凍干燥機（LYOQUEST-85）：西班牙泰士達公司；超低溫冰箱（Thermo702）：賽默飛世爾科技有限公司；萬能材料試驗機：山東濟南普創機電有限公司；圓二色譜儀（Jasco-815）：日本分光（JASCO 公司）；納米粒度 Zeta 電位分析儀（Zetasizer Nano zs90）：英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

取適量玉米黃粉，經酶法除淀粉、脫色后的樣品，用70%（體積分數）濃度乙醇溶液浸提2 h，5 000 r/min離心15 min，取上清液，用冰水浸提，調pH6 左右，離心后得到沉淀，水洗，冷凍干燥，得到玉米醇溶蛋白樣品，備用。

1.3.2 糖基化改性及膜的制備

用70%的乙醇溶液溶解玉米醇溶蛋白，配制8%的蛋白溶液，按一定物料比加入菊粉，攪拌溶解后，調pH 值，以不同功率對溶液進行超聲處理，凍干后粉粹，放入溫度60 ℃，濕度為79%的密閉干燥器中進行糖基化反應，反應后立即冷卻，置于30 ℃的烘箱中烘干剩余水分，得到改性后的糖基化產物（zein-inulin）樣品。

將改性后的產物用70%乙醇溶解后，倒入模具于70 ℃烘箱烘干成膜。將烘干后的膜于溫度30 ℃、相對濕度43%干燥器內平衡48 h，備用。

1.3.3 巰基和二硫鍵含量的測定

采用 Ellman’s 試劑比色法[25]測定。5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸在pH8.0 時與巰基相互作，生成硫代硝基苯陰離子，硫代硝基苯陰離子在412 nm 處的摩爾吸光系數ε=13 600，吸光值與巰基的數量成正比[26]。具體步驟如下：

取75 mg 樣品用1 mL Tris-甘氨酸緩沖液混勻后加4.79 g 鹽酸胍，用緩沖液定容至10 mL。

測定巰基時，取1 mL 該液加4 mL 脲-鹽酸胍溶液和0.05 mL Ellman's 試劑，于412 nm 處測吸光值。

測定二硫鍵時，取1 mL 溶液，加0.05 mLβ-巰基乙醇和4 mL 脲-鹽酸胍溶液，于25 ℃保溫1 h，然后加入10 mL 12%三氯乙酸，繼續于25 ℃恒溫1 h，經5 000 r/min 離心10 min 后，用5 mL 12%三氯乙酸清洗沉淀物2 次，將沉淀物溶于10 mL 8 mol/L 脲中，加0.04 mL Ellman’s 試劑，測取 412 nm 處的吸光值。

計算如下式：

式中：μ巰基代表巰基含量；A412為 412 nm 處的吸光值；D 為稀釋因子（巰基取5.02，巰基+還原的二硫鍵取10）：C 為樣品濃度，mg/mL。

式中：μ二硫鍵代表二硫鍵含量；N1為還原前的巰基數；N2為還原后的巰基數。

1.3.4 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛（OPA）法[24]測定。

按照文獻配制試劑，測定時，移取4 mLOPA 試劑于試管中混勻，加入蛋白濃度為10 mg/mL 樣品液200 μL，再次混勻后于 35 ℃水浴反應 2 min，在 340 nm下測其吸光值。OPA 溶液中加入200 μL 賴氨酸代替樣品液為空白。二者之差為游離氨基的凈吸光值并作出賴氨酸的標準曲線為y=1.914x-0.001，r2=0.999 0，根據凈吸光值計算樣品中游離氨基的含量。接枝度按照下式計算：

式中：C0為未改性前溶液中游離氨基的含量，mol/L；C1為改性后溶液中游離氨基的含量，mol/L。

1.3.5 蛋白膜抗拉強度測定

將膜剪成15 mm×85 mm 的矩形長條，置于萬能材料試驗機上，固定好，夾距設定為45 mm，拉伸速度為100 mm/min。計算如下式：

式中：TS 為抗拉強度，MPa；F 為最大拉力，N；L 為膜樣品的厚度，mm（采用測厚儀對樣品膜的4 個邊緣處和中心處分別重復3 次，求平均值為該膜厚度）；W為膜樣品的寬度，mm。

1.3.6 粒徑的測定

將玉米醇溶蛋白與其改性產物用70%乙醇溶液充分溶解后，經不同的超聲功率處理后，用納米粒度Zeta 電位分析儀將樣品依次進行測定。

1.3.7 圓二色譜的測定

樣品溶液的配制：準確稱取一定量玉米醇溶蛋白與改性產物，用70%乙醇溶液配成濃度為0.02 mg/mL的蛋白樣品溶液，樣品進行0.22 μm 有機相膜過濾后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

遠紫外區的CD 譜測定：將樣品注入光徑10 mm的石英樣品池，采用Jasco-815 圓二色譜儀對樣品在198 nm～260 nm 進行掃描，掃描速率為 100 nm/min，響應時間0.5 s，譜帶寬度1.0 nm，靈敏度為20 mdeg，與室溫下重復掃描樣品8 次，記錄CD 譜，求平均值作為最終光譜值。得到蛋白質的平均摩爾橢圓吸收率用[θ]（deg cm2/dmol）表示，根據Chen-Yang 原理和最小二乘法編寫的程序計算出蛋白質的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的百分含量。

1.4 數據處理方法

2 結果與討論

2.1 超聲功率對接枝度的影響

接枝度表示在糖基化反應中，蛋白質與糖發生接枝反應的程度，本研究比較了經不同超聲功率預處理后的接枝度，結果如圖1 所示。

圖1 接枝度變化圖Fig.1 Grafting degree change diagram

由圖1 可知，超聲功率的變化會影響玉米醇溶蛋白與菊粉之間糖基化反應接枝度的大小。隨著超聲功率的增大，糖基化改性產物的接枝度有逐漸增大的趨勢。當超聲功率在400 W 時，接枝度達到最大值，為31.25%，隨后繼續提高超聲功率至500 W，其接枝度反而開始下降至28.65%。說明當超聲功率增大時，在溶液中形成更高頻率的振蕩，蛋白質分子的空間結構被破壞，致使肽鍵斷裂，導致N-末端游離殘基數目過度增多，自由氨基也過度增多，菊粉中的還原糖與賴氨酸的碰撞幾率變小，導致了糖基化改性的接枝度下降[27]。

2.2 不同超聲功率對巰基和二硫鍵的影響

蛋白質是由α-氨基酸通過肽鍵連接而成的具有四級空間結構的復雜高分子化合物。超聲處理在一定程度上使蛋白質內不同的氨基酸基團暴露，使得與這些基團緊密相關的結構特性也發生相應的改變。不同超聲功率對巰基和二硫鍵的影響見表1。

表1 超聲功率對蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Table 1 Effect of ultrasonic power on sulfydryl group and disulfide bond of zein

由表1 可知，純玉米醇溶蛋白中原始自由巰基含量為 6.7 μmol/L pro，二硫鍵含量為 18.55 μmol/L pro。在糖基化改性過程中，隨著超聲功率的逐漸增加，超聲過程中產生的空穴效應和機械作用對蛋白質的作用位點產生剪切力，將蛋白質上的肽鏈打斷，破壞其一級結構和二級結構，蛋白分子內部殘基受到破壞使其暴露于蛋白分子表面，部分還原成巰基[18]。另一方面，超聲波處理使蛋白結構得到伸展，原本包埋在蛋白質分子內部的巰基逐漸暴露出來，使糖基化改性產物的自由巰基含量逐漸上升，二硫鍵的含量逐漸下降[28]。另外在前期研究中也發現[27]，當超聲功率超過最適值后，繼續提高超聲功率，會使改性后的蛋白成膜效果也下降，這可能是因為蛋白膜具有良好的成膜性是與氨基酸分子中的二硫鍵含量有關，因此隨著超聲功率的增加，二硫鍵呈減少趨勢，不利于成膜，因此在最適超聲功率條件下，適量減少蛋白質的二硫鍵含量，可增加蛋白膜的柔韌性。

2.3 超聲功率對玉米醇溶蛋白膜機械性能的影響

本研究考察不同超聲功率對玉米醇溶蛋白-菊粉膜抗拉強度、伸長率的影響，結果如圖2 所示。

圖2 超聲功率對抗拉強度與伸長率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on tensile strength and elongation of zein

蛋白質的結構特性是決定其膜機械性能的基礎。蛋白質空間結構的改變會在一定程度上引起蛋白膜機械性能的變化。在糖基化改性過程中，蛋白質與菊粉發生糖基化反應，使改性后玉米醇溶蛋白的空間結構也發生變化，即蛋白質分子發生一定程度的伸展，促使蛋白分子成膜時疏水基團和巰基交聯而富有柔韌性，增加膜的機械性能[29]。表征膜機械強度的指標通常采用抗拉強度和斷裂伸長率。圖2 結果表明，超聲波功率變化對玉米醇溶蛋白-菊粉膜的機械強度同樣產生影響。隨著超聲功率的逐漸增大，玉米醇溶蛋白-菊粉膜的抗張強度和伸長率都呈現出先升高后降低的趨勢。當超聲功率為500 W 時，蛋白膜的抗張強度和伸長率均達到最高值。說明此時對玉米醇溶蛋白進行糖基化改性后的蛋白膜的機械性能較好。但當超聲功率大于500 W 時，蛋白膜的機械強度反而下降，說明功率過高并不利于蛋白膜的機械性能的提高，這與文獻一致[30]。本文重點考察超聲對蛋白膜機械強度的提高，因此選擇500 W 的超聲功率。

2.4 粒徑分析

本研究對不同超聲功率預處理后糖基化改性的蛋白產物進行粒徑檢測，結果如表2 所示。表中蛋白質分散系數（polymer dispersity index，PDI）為代表溶液的分散程度，PDI 值越小，代表溶液的分散性越好[32]；而粒徑大小直接影響后期蛋白成膜的機械性能，分子粒徑越大，蛋白膜的成膜性越好，抗拉強度越大。

表2 超聲功率對玉米醇溶蛋白-菊粉粒徑分布的影響Table 2 Effect of ultrasonic power on size distribution of zeininulin

隨著超聲功率的增加，粒徑大小有逐漸升高的趨勢，但當超聲功率達到550 W 時，粒徑急劇減小，這可能是由于超聲功率過大會導致蛋白分子內部細胞破碎，粒徑減小。超聲功率在350 W 時，溶液的分散性較好，但其粒徑大小為1 458 nm，相比超聲功率為500 W時的粒徑大小2 113 nm 小得多。本文主要研究蛋白質的成膜性，即機械性能，所以綜合以上分析，認為超聲功率為500 W 時粒徑最大，溶液分布較均勻，結合圖2中超聲功率對抗拉強度的影響，認為在該條件下制得的蛋白膜機械性能較好。

2.5 圓二色譜分析

通過蛋白質的圓二色譜圖（circular dichroism，CD）的遠紫外區譜帶位置和吸收強弱的分析，可確定蛋白質和肽二級結構。本研究以超聲條件為500 W 的玉米醇溶蛋白-菊粉與玉米醇溶蛋白，進行比較，考察超聲后的糖基化產物二級結構的變化，結果如圖3 和表3所示。

圖3 圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra

表3 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉的二級結構組成Table 3 Secondary structure content of zein and zein-inulin g/100 g 氨基酸

由圖3 分析可知，玉米醇溶蛋白的遠紫外區CD光譜的肽鍵吸收峰在207 nm 附近有一較強的負峰，在224 nm 有一很強的負峰，此處為α-螺旋結構特征峰，在218 nm 附近有一負峰，此處為β-折疊結構特征峰，與報道的α-zein 中Z19 蛋白CD 特征峰相似[32]。一般而言，當蛋白質二級結構被完全破壞時，而吸收峰會發生紅移或藍移現象。由圖3 可知，糖基化反應后，接枝產物在207 nm 處的負峰強度有降低趨勢，224 nm處的負峰有藍移現象，218 nm 負峰有紅移現象。結果表明經菊粉改性后的玉米醇溶蛋白改變了蛋白質的二級結構，破壞了原玉米醇溶蛋白中的二硫鍵。

Frank A.等[33]用CD 測定玉米醇溶蛋白在50 %～80 %乙醇溶液中的二級結構研究發現α-螺旋結構的含量在33%～60%之間，且α-螺旋和β-折疊含量接近。由表3 可知，本研究中玉米醇溶蛋白的圓二色譜遠紫外圖譜中，其二級結構的主要結構以α-螺旋結構為主，約占50%，這與該文獻中玉米醇溶蛋白的α-螺旋含量相符，除此之外還含有β-折疊和無規則卷曲，各自約占25%左右，其中α-螺旋結構含量是β-折疊的2 倍左右，有研究認為這與玉米醇溶蛋白提取條件有關[34]。

蛋白質中多肽鏈的α-螺旋結構由分子間氫鍵作用形成的，經超聲輔助改性后α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，無規則卷曲含量略有升高，仍沒有β-轉角結構。說明超聲輔助糖基化改性后，一方面氫鍵受到破壞，α-螺旋發生一定的解鏈，結構變得更加松散[35]。另一方面，與菊粉中的還原羰基反應的ε-氨基位于α-螺旋結構中，因此，ε-氨基與多糖的結合是造成α-螺旋結構的減少主要原因[36]。另外蛋白質的折疊結構發生了去折疊，更多的糖越容易接入蛋白質肽鏈中，后期在超聲的機械作用和熱效應下又進行了再折疊，β-折疊含量增加了11.3%，因此超聲輔助糖基化改性使得玉米醇溶蛋白二級結構發生變化，分子由有序變得無序。這樣，玉米醇溶蛋白-菊粉分子脆性結構減弱，韌性結構增加，提高了機械性能。

3 結論

本研究以玉米醇溶蛋白為氨基供體，利用超聲波技術輔助菊粉糖基化改性，得出如下結論。

1）超聲波處理可以促進玉米醇溶蛋白糖基化反應，尤其在適當功率下超聲使蛋白結構得以伸展，蛋白中自由氨基含量增加，使接枝反應中蛋白氨基和糖類羧基交聯機遇增大，促進了接枝反應的發生，從而使玉米醇溶蛋白得到適度的糖基化改性，修飾蛋白結構。

2）超聲波作用增加了糖基化改性蛋白質的自由巰基的含量，促進了在成膜形成過程中二硫鍵的形成。說明超聲作用后玉米醇溶蛋白自由巰基的含量增加，使其在成膜過程中二硫鍵生成量增加，由于膜的形成是蛋白通過疏水基團以及二硫鍵形成分子量更大的聚集體，聚集體產生內聚性的力打破維系天然蛋白分子間的作用力促使蛋白分子發生重排，形成新的相互作用力以支撐新的蛋白結構使膜結構發生變化，降低膜的脆性，增強膜的韌性，從而提高膜的機械性能。