高產不飽和油脂海鞘真菌桔青霉Asc-2-4的誘變選育

羅國聰，柴慧子，雷曉凌*, 聶芳紅，羅正東

(1. 廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 暨南大學 病原微生物研究所，廣東 廣州 510632)

海鞘是海鞘綱的尾索動物，屬于海洋污損生物之一，其獨特的濾食系統使其富集了大量的微生物[1]。近年來，國內外報道了從海鞘中發現了很多生物堿、萜類、甾體等活性物質，具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物等顯著的生物活性[2]，相對于陸地真菌而言，海洋真菌能夠耐受海洋特有的如高鹽、高壓、低氧、低光照等多種極端條件，因此產生了化學結構獨特的次級代謝產物[3]。某些微生物能夠在一定條件下將碳源、氮源以及一些無機鹽轉化，油脂含量達到其生物量的20%以上，稱為產油微生物[4]。產油真菌是其中的一大類，如深黃被孢霉、高山被孢霉和拉曼被孢霉等。產油真菌在不同環境下的適應能力很強，多產碳十六和碳十八系列不飽和脂肪酸，發酵產油具有周期短，不受產地限制等優勢[5]，可以作為生物油脂的菌種來源或作為優質脂肪酸的補充來源。發展生物油脂能改善我國的能源結構，獲取產油性狀良好的菌株是發酵產油的一個關鍵因素，獲取一株優質的產油菌株已成為國內外研究的熱點。誘變育種技術是獲得高產突變菌的一種有效方式,本研究前期從海鞘中篩選得到1株高產油脂的海鞘共附生真菌桔青霉(Penicilliumcitrinum)Asc-2-4[6]，期望通過紫外線-氯化鋰復合誘變[7]，結合丙二酸篩選技術，選育出高產突變株，以期提高菌株的油脂產量和不飽和脂肪酸產量，可望作為功能性油脂微生物被開發利用，為開發海洋真菌油脂資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 前期從海鞘中分離出的1株高產油脂的真菌，桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)Asc-2-4，NCBI登錄號為KX462901，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：60059。

1.1.2 培養基(g/L) ①種子培養基：馬鈴薯粉 28，海精鹽 30，酵母膏 1，(NH4)2SO410，pH自然；②發酵培養基：馬鈴薯 200，葡萄糖 100，KH2PO42，蛋白胨 0.5，酵母膏 0.5，檸檬酸鈉 0.1，海精鹽 30，K2HPO40.2，pH自然。

1.1.3 試劑與儀器 氯化鋰、丙二酸、氯仿、氫氧化鉀、鹽酸均為分析純；14%三氟化硼甲醇溶液為色譜純。HYG-A全溫振蕩培養箱(金壇市萬華實驗儀器廠)；BMJ-250霉菌培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療機械廠)；GC-2010PLUS自動進樣氣相色譜儀(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1 紫外線-氯化鋰復合誘變 菌株Asc-2-4取出后接種至馬鈴薯葡萄瓊脂培養基平板中，(28±1) ℃活化培養3～4 d，活化3代，用接種環刮取菌絲體的孢子到10 mL 0.9%的無菌生理鹽水中，制備孢子懸液，加蒸餾水稀釋，調整孢子懸液濃度在106～108個/mL。為了研究紫外線-氯化鋰的最適誘變時間，以紫外線-氯化鋰誘變時間為自變量，孢子存活率為因變量，制作存活率曲線。誘變時間為0、30、60、90、120 s，誘變結束后，取200 μL孢子懸液，涂布于PDA平板，每組3個平行，(28±1) ℃避光培養3 d，以菌落形成單位(CFU)計算存活率，對照組為未經誘變處理的孢子懸液[8]。

存活率(%)=(誘變后菌落形成數/空白對照菌落形成數)×100%

1.2.2 丙二酸篩選濃度的確定 向冷卻至50 ℃的100 mL PDA培養基中分別加入500 g/L的丙二酸溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，分別配制出0、1、2、4、6 g/L質量濃度的丙二酸PDA培養基，接種出發菌株孢子懸液到含丙二酸的平板中，涂布均勻，(28±1) ℃培養3 d。與對照組比較，確定丙二酸臨界濃度[9]。

1.2.3 發酵培養基無機鹽的條件優化 在前期的單因素試驗中，發現MgSO4、KH2PO4、FeCl3三種無機鹽對突變菌Asc-2-4-1的產油含量有影響，以KH2PO4、MgSO4、FeCl3設置正交試驗，即KH2PO4(3、4、5 g/L)，MgSO4(50、100、150 mg/L)，FeCl3(2、4、6 mg/L)，以油脂得率為考量指標，考察KH2PO4、MgSO4、FeCl3對菌株Asc-2-4-1產油脂的影響，從而確定這三種無機鹽的最佳配比。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.4 培養與測定方法 ①搖瓶種子培養：從斜面中挑取1環菌絲到種子培養基中，(28±1) ℃，180 r/min搖床培養48 h。②搖瓶發酵培養：以5%(體積分數)的接種量將種子液接種到發酵培養基中，180 r/min，(28±1) ℃恒溫搖床培養7 d。③生物量的測定：采用干重法測量生物量。④油脂的提?。撼暡ㄝo助酸熱法提取油脂[10]。油脂經甲酯化處理[11]，氣相色譜分析脂肪酸成分。⑤計算公式：生物量(g/L)=干菌體質量/發酵液體積；油脂含量(%)=(提取油脂的質量/干菌體質量)×100%；油脂得率(g/L)=生物量(g/L)×油脂含量(%)；不飽和脂肪酸含量(g/L)=油脂得率(g/L)×不飽和脂肪酸百分含量(%)。

2 結果與分析

2.1 紫外線-氯化鋰復合誘變時間的確定

紫外線-氯化鋰復合誘變育種技術是獲得高產突變菌的一種有效方式。紫外線是物理誘變劑，氯化鋰是一種堿金屬鹵化物，本身不具備誘變作用，但可以協助加強紫外線的誘變作用[12]。

紫外線-氯化鋰復合誘變的孢子存活率曲線如圖1，菌株孢子懸液存活率隨著誘變時間增加而降低?，F代育種理論認為，當菌株存活率在20%～30%時，正突變率會相對較高[13]。因此本研究確定最佳的誘變時間為70 s，與孫登岳[14]確定的紫外線-氯化鋰復合誘變時間相近。

圖1 紫外線-氯化鋰復合誘變存活率曲線Fig.1 The curve of survival ratio of Asc-2-4 mutated by UV and LiCl

2.2 丙二酸篩選濃度的確定

丙二酸抗性菌株的ATP代謝比較高，在發酵前期有利于菌體的生長，在發酵后期有利于微生物合成油脂。丙二酸結構類似于琥珀酸，能夠競爭性抑制琥珀酸脫氫酶，能夠抑制三羧酸循環，屬于呼吸酶抑制劑[9]，見表2。

當丙二酸的添加量大于4 g/L時，幾乎所有菌落都不能生長，抑制率達到100%；當丙二酸添加量為1 g/L，達不到抗性篩選的效果；當丙二酸添加量為2 g/L時，部分菌落能正常生長，菌落直徑較大。因此選用2 g/L的丙二酸作為篩選劑量加入平板培養基中，對突變菌進行選擇。所確定的丙二酸質量濃度比陳金卿等[15]篩選耐丙二酸高產DHA菌株的質量濃度(0.5 g/L)略高，該質量濃度能保障起到一定的篩選作用，能篩選出一些性能較好的突變菌，為下一步研究提供優質菌種。

表2 不同濃度的丙二酸對Asc-2-4的抑制作用

2.3 高性能突變菌株的復篩

將出發菌株和突變菌株搖瓶發酵，得到的生物量、油脂含量、油脂得率如圖2所示。

圖2 出發菌株和突變菌株的生物量和油脂得率比較Fig.2 The compare on biomass and lipid synthesis of original strain and mutant strains

由圖2可知，各菌株的生物量都保持在11～13 g/L的范圍，出發菌株Asc-2-4的油脂含量為30.05%，與之相比，有兩株突變菌株油脂含量和油脂得率有所提高。 Asc-2-4-1的油脂含量為57.99%，提高了92.98%；Asc-2-4-5的油脂含量為40.28%，提高了34.04%。而就油脂得率而言，出發菌株為3.85 g/L，Asc-2-4-1和Asc-2-4-5分別為7.10 g/L和4.80 g/L，相對于出發菌株來說，油脂得率都有所提高，分別提高了84.42%和24.68%。綜合比較生物量，油脂合成能力，突變菌Asc-2-4-1產油脂具有較大優勢，所以選擇突變菌株Asc-2-4-1用于后續的發酵條件優化。該菌株保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，編號為GDMCC No：60609。

2.4 無機鹽添加量的優化

在前期的單因素試驗中，發現FeCl3、MgSO4、KH2PO4三種無機鹽對突變菌Asc-2-4-1的產油含量有影響，設置不同配比的無機鹽添加到發酵培養基中，期望得到其發酵培養基中無機鹽添加量的最佳配比，見表3。

表3 無機鹽正交試驗

以油脂得率為考查指標，由極差分析和方差分析可見，影響油脂得率因素的順序為FeCl3> MgSO4> KH2PO4(C>B>A)，其中FeCl3的添加量對油脂得率的影響最為顯著，最優配比為C3B1A1，即FeCl36 mg/L、MgSO450 mg/L、KH2PO43 g/L。

2.5 突變菌株Asc-2-4-1優化前后產油脂能力比較

從表4可以看出，優化前后脂肪酸百分含量是比較接近的，對照組的不飽和脂肪酸百分含量為53.80%，優化組的不飽和脂肪酸百分含量為54.07%。對照組和優化組的生物量較相近，最后得到優化組的油脂含量、油脂得率和不飽和脂肪酸含量均有小幅度的提升。

C16∶0向C18∶0轉化的碳鏈延長是合成ω-3系列不飽和脂肪酸過程中一個重要的步驟，∑C18/∑C16的比值可以反映碳鏈延長酶的延長碳鏈能力，比值越大說明菌株合成ω-3系列不飽和脂肪酸的能力越強[16]。

表4 突變菌株Asc-2-4-1優化前后發酵參數對比

從圖3可以看出，與對照組相比，優化組的∑C18/∑C16比值明顯增大，表明優化后的發酵培養基有利于合成ω-3系列不飽和脂肪酸。

圖3 菌株Asc-2-4-1金屬離子優化前后主要脂肪酸含量對比Fig.3 Analysis of total fatty acid compositions of before and after optimization

2.6 突變菌Asc-2-4-1油脂成分分析

所含主要脂肪酸成分如圖4所示，有棕櫚酸(C16∶0)占17.35%；硬脂酸(C18∶0)占24.79%；油酸(C18∶1)占24.40%；亞油酸(C18∶2)占28.59%；飽和脂肪酸(棕櫚酸，硬脂酸)占其脂肪酸成分42.14%；不飽和脂肪酸(油酸，亞油酸)占其脂肪酸成分52.99%。

圖4 菌株Asc-2-4-1油脂的脂肪酸成分分析Fig.4 Analysis of fatty acid compositions of fungi Asc-2-4-1

次要脂肪酸成分有十五烷酸(C15∶0)，銀杏酸(C15∶1)，棕櫚油酸(C16∶1)，十七烷酸(C17∶0)，花生酸(C20∶0)，二十二烷酸(C22∶0)，二十四烷酸(C24∶0)，α-亞麻酸(C18∶3)、二十四烷酸(C24∶0)。從Asc-2-4-1提取的粗油脂如圖5所示。

圖5 從Asc-2-4-1提取的粗油脂Fig.5 Crude oil extracted from fungi Asc-2-4-1

3 討 論

本研究通過建立紫外線-氯化鋰誘變，結合丙二酸(2 g/L)初篩的方法，成功獲得4株油脂得率更高的突變菌株，其中2株的油脂得率有所提高，Asc-2-4-1和Asc-2-4-5的油脂得率分別提高了84.42%和24.68%。李慧玲等[17]采用紫外線和硫酸二乙酯復合誘變得到1株高產油脂突變XN001，生物量為22.38 g/L，油脂含量為45.73%。突變菌Asc-2-4-1的生物量為12.25 g/L，油脂含量為57.99%，與之相比，Asc-2-4-1的生物量稍低，油脂含量基本在同一范圍內，說明本研究誘變-篩選方法的效率高，有一定的可行性。此外，培養基經過無機鹽優化后，突變菌Asc-2-4-1的不飽和脂肪酸含量提高了6.96%，表明Fe3+、Mg2+可促進油脂積累、生物量增加，從而提高油脂得率，并且菌株的不飽和脂肪酸產量越高，長鏈的不飽和脂肪酸越多，易流動，有利于油脂的運輸[18]。

目前研究青霉發酵產油的脂肪酸組成成分主要有油酸、棕櫚酸和亞麻酸[19]。油酸是一種人體必需的營養物質，可延緩動脈粥樣硬化，對高血壓患者有很好的保健作用，是Asc-2-4-1所產生的油脂中的主要成分之一，占油脂提取物的24.40%，可作為生產油酸的生物油脂來源之一。

突變菌Asc-2-4-1的油脂含量最高可達58.04%，與已發現的通過發酵條件優化和誘變育種的青霉菌生產油脂含量最高為64.15%[20]相比，其油脂含量較接近，但其生物量稍顯不足，后續可通過碳源、氮源、碳氮比等培養基優化方法提高菌體含量，還可進行發酵罐發酵，調節溶氧量提高菌體的生物量。海洋真菌作為海洋微生物的一個重要類群，具有研究和開發的巨大潛力[21]。