低濃度苯和甲醛經呼吸道聯合染毒對小鼠雌性生殖毒性的影響

鄒麗君，高艷芳，賀印旎2，張娟，胡恭華

(1. 贛南醫學院基礎醫學院，江西 贛州 341000；2. 邵陽學院生物遺傳教研室，湖南 邵陽 422000)

苯和甲醛作為常見的工業原料在各行各業中應用廣泛，成為典型的職業環境污染物和室內空氣污染物[1]，引發的健康問題也成為國內外學者的研究熱點。苯和甲醛均是人類確認的致癌物，兩種毒物共同暴露可導致造血系統、神經系統、生殖系統等多種健康損害[2-4]。其中雌性生殖功能損害涉及親子兩代、毒作用表現更復雜，尤其低濃度苯和甲醛于卵泡發育期的聯合暴露導致對雌性小鼠的生殖功能損害的研究較少。本文擬通過對卵泡發育期ICR小鼠進行低濃度苯和甲醛的聯合暴露來探討苯和甲醛的雌性生殖毒性，為苯和甲醛的生殖毒性評價提供參考線索和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雌性ICR小鼠108只，平均體重26.56 g，SPF級雄性ICR小鼠27只，平均體重28.75 g[購自湖南斯克景達實驗有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002，使用許可證編號SYXK(贛)2018-0004)]。屏障環境飼養和染毒，溫度為18℃～24℃，濕度為40%～60%。

1.2儀器和試劑 55 L靜式染毒柜(實驗室自制，塑料材質、可密封、透明)，Sorvall ST 8R型高速冷凍式離心機(美國Thermo Fisher)，EON-EPOCH酶標儀(美國Biotek)，ZXDP-R2800電熱恒溫培養箱(上海智城)，玻璃勻漿器；苯(分析純，國藥集團)，37%甲醛水溶液(分析純，國藥集團)，0.01 M PBS緩存液，SOD和MDA試劑盒(南京建成)，FSH和LH酶聯免疫試劑盒(武漢華美)。

1.3實驗方法

1.3.1分組和染毒 將108只SPF級雌性ICR小鼠采用兩個因素、三個劑量水平(32)的析因設計進行隨機分組，苯和甲醛各三個劑量水平分別為：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，共有9個不同染毒組，每組12只。呼吸道靜式染毒，于雌鼠卵泡發育期連續染毒14 d，2 h/d(中間間隔1 h)。染毒期間禁食禁水，其余時間自由飲水攝食，每7 d測量一次體重。染毒第13 d、14 d清晨連續2 d采用普通光學顯微鏡觀察雌鼠陰道分泌物的方法判定雌鼠的動情周期，篩選動情期的雌鼠于染毒結束處死并采集生物標本進行指標檢測，每組滿足6只，剩余雌鼠與雄鼠按2∶1的比例進行持續3 d的合籠交配再分籠飼養至雌鼠產下仔鼠、喂養4 d后處理全部動物。

1.3.2雌鼠體重的稱量 經呼吸道14 d染毒期間每7 d測量一次體重，后續繼續交配并產仔的雌鼠每7 d測量一次體重。

1.3.3雌鼠動情周期的判定 染毒第13 d、14 d清晨7：00對所有染毒雌鼠進行陰道分泌物涂片檢查以判定動情周期，第13 d篩選動情前期動物，篩選標準為鏡下有核上皮細胞占多、少量自細胞和角質化上皮細胞，第14 d篩選動情期動物，篩選標準為鏡下大量角質化上皮細胞、典型樣本呈落葉狀。通過連續2 d對雌鼠動情周期的判定以保證染毒結束時處死的雌鼠均同步在動情期，雌鼠性激素水平具有可比性，每組滿足6只。

1.3.4雌鼠臟器系數的計算 染毒結束時篩選動情期的雌鼠采血后處死并解剖分離心、肝、脾、腎、子宮、卵巢，小心剪除結締組織后于PBS緩沖液沖洗血污，濾紙吸干后快速在電子天平上稱量并記錄。

1.3.5雌鼠子宮組織超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測定 染毒結束時將篩選動情期的雌鼠處死，解剖分離子宮，稱量約0.1 g子宮組織與PBS緩沖液按1∶9用玻璃勻漿器制備10%子宮勻漿，10 min 3000 r/min離心，取上清液按照南京建成試劑盒的說明書測定和計算子宮組織SOD活力和MDA含量。

1.3.6雌鼠血清卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)含量測定 染毒結束時篩選動情期雌鼠進行10%水合氯醛麻醉后摘眼球取血，5 min 2000 r/min離心分離血清，按照武漢華美酶聯免疫試劑盒的說明書測定和計算FSH和LH含量。

1.3.7母鼠生育力及胎仔發育毒性判定 觀察交配行為及妊娠結局(產仔數、活仔數，每窩平均體重)，計算生育指數、妊娠指數、活產指數和4 d存活指數。生育指數=(與雄鼠交配受孕的雌鼠數/與雄鼠同籠的雌鼠數)×100%，妊娠指數=(正常分娩雌鼠數/妊娠的雌鼠數)×100%，活產指數=(活產胎仔數/胎仔總數)×100%，4 d存活指數=(哺乳4 d存活仔鼠數/活產胎仔總數)×100%。

2 結果

2.1苯和甲醛聯合染毒14 d雌鼠體重變化情況 苯不同劑量組雌鼠體重增長不同，差異有統計學意義(P<0.05)，甲醛不同劑量組的體重增長呈現劑量越高增長越緩慢趨勢，但差異無統計學意義，苯和甲醛聯合染毒對雌鼠的體重增長有交互作用，有統計學意義(P<0.05)，表現為低劑量聯合組體重增長較少(G6組平均體重增長為1.68 g)，高劑量聯合組體重增長較多(G9組平均體重增長為2.95 g)。合籠交配產仔的孕鼠因受孕時間有先后，受孕后的體重變化無法同步，組間和組內的體重變化雖有記錄但缺乏可比性。見表1、表2。

表1 苯和甲醛聯合染毒14 d雌鼠體重變化情況

表2 各組雌鼠體重變化方差分析結果

2.2苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠臟器系數的影響 各處理組的心臟系數、肝臟系數、子宮系數的差異無統計學意義，無主效應及交互作用；苯不同劑量組和甲醛不同劑量組的脾臟系數的差異有統計學意義(P<0.05)，無交互作用；苯不同劑量組的腎臟系數、卵巢系數的差異無統計學意義，甲醛不同劑量組的腎臟系數、卵巢系數差異有統計學意義(P<0.05)，無交互作用。見表3、表4

表3 苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠臟器系數的影響

表4 各組雌鼠臟器系數方差分析結果

2.3苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量的影響 苯不同劑量組和甲醛不同劑量組的子宮組織SOD活力的差異有統計學意義(P<0.05)，無交互作用；甲醛不同劑量組的子宮組織MDA含量的差異有統計學意義(P<0.05)，苯和甲醛聯合染毒對雌鼠子宮組織MDA含量有交互作用，有統計學意義(P<0.05)，表現為低劑量聯合組升高較少(G6組平均MDA含量為6.50 nmol/mg prot)，高劑量聯合組升高較多(G9組平均MDA含量為7.79 nmol/mg prot)，但均低于高劑量甲醛組(G5組平均MDA含量為9.04 nmol/mg prot)。見表5、表6。

表5 苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量的影響

2.4苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠血清FSH和LH的影響 苯和甲醛單獨染毒對雌鼠血清FSH無主效應，苯和甲醛聯合染毒對雌鼠血清FSH有交互作用，有統計學意義(P<0.05)，表現為低劑量聯合組升高較多(G6組平均FSH為64.52 mIU/ml)，高劑量聯合組升高較少(G9組平均FSH為54.85 mIU/ml)。各處理組的LH差異無統計學意義，無主效應及交互作用。見表7、表8。

表6 各組雌鼠子宮組織SOD活力和MDA含量方差分析結果

表7 苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠血清FSH和LH的影響

表8 各組雌鼠血清FSH和LH方差分析結果

2.6苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠生育力和胎仔發育的影響 苯和甲醛單獨染毒時低劑量組的生育指數均低于高劑量組，而低劑量組的妊娠指數均高于高劑量組，苯和甲醛低劑量聯合組的生育指數高、妊娠指數低，高劑量聯合組的生育指數低、妊娠指數高；苯不同劑量組的產仔數、活仔數、活仔重、4 d存活指數及4 d活仔重差異無統計學意義，甲醛不同劑量組的產仔數、活仔數、活仔重、4 d存活指數及4 d活仔重差異有統計學意義(P<0.05)，苯和甲醛聯合染毒的14 d存活指數、4 d活仔重有交互作用，有統計學意義(P<0.05)，表現為低劑量聯合組降低(G6組平均4 d存活指數為93.60%及4 d活仔平均重為2.33 g)，高劑量聯合組升高(G9組平均4 d存活指數為100.00%及4 d活仔平均重為2.61 g)。見表9、表10、表11。

表9 苯和甲醛聯合染毒14 d對雌鼠生育力的影響

表10 苯和甲醛聯合染毒14 d對胎仔發育的影響

表11 各組胎仔發育方差分析結果

3 討論

苯和甲醛作為人類確認的致癌物和致突變物，經常聯合暴露于職業環境和室內環境，如化工行業中用于原料生產各類化工產品、作為溶劑和助劑用于噴漆印刷行業和家居裝修材料等。職業流行病學調查顯示職業環境苯暴露可導致女工月經紊亂，增加自然流產率，降低女性生育能力[5-6]，對新裝修居室的人群進行流行病學調查也發現女性生殖功能損害與居室環境的苯和甲醛暴露相關[7]。隨著國家職業衛生標準和環境衛生標準的推廣實施，職業環境和室內環境中苯和甲醛的暴露通常在較低的水平，在這種情況下，兩者是否存在聯合作用、其生殖損害呈現何種特征是一個新的命題。

本次研究采用兩個因素、三個劑量水平(32)的析因設計對卵泡發育期的ICR雌鼠進行單獨染毒和聯合染毒，苯和甲醛各三個劑量水平分別為：0 mg/m3、12 mg/m3、60 mg/m3和0 mg/m3、2 mg/m3、10 mg/m3，連續染毒14 d，基本覆蓋雌鼠3個動情周期，以確保交配時排出的卵子都存在毒物暴露，染毒結束后每組篩選6只動情期的動物檢測性激素等指標，每組其他雌鼠繼續觀察交配分娩產仔等生殖毒性終點。本研究的設計特點有：①依據職業環境和室內環境低濃度、聯合暴露的情況，采用低濃度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)聯合暴露，分析兩種毒物單獨染毒的毒效應及聯合染毒的毒效應，為職業和環境衛生評價提供參考；②與傳統胚胎植入期、器官形成期染毒不同，本次研究選擇卵泡發育期進行雌性動物染毒，染毒后即雌雄交配，毒物作用于卵細胞的發育過程，為育齡期女性生殖功能損害提供參考；③實驗觀察的終點涉及親子兩代，既有母鼠的系統毒性、生育力，又有胎仔的發育毒性，從親子兩代闡述毒物的生殖損害，為苯和甲醛的生殖毒性評價提供參考。

體重是反映機體系統毒性的重要指標，從染毒期間雌鼠體重變化的析因分析結果來看，苯不同劑量組雌鼠體重增長不同，差異有統計學意義，甲醛不同劑量組的體重增長無統計學意義，苯和甲醛聯合染毒對雌鼠的體重增長有交互作用，表現為低劑量聯合組體重增長較少，高劑量聯合組體重增長較多，說明該劑量下的苯對小鼠體重的影響要高于甲醛，聯合染毒時甲醛的暴露抵消了苯對體重的影響。動物臟器系數的改變為確定毒作用的靶器官提供線索。從實驗結果來看，14 d短時間、低濃度的苯暴露對脾臟系數有一定影響，提示該劑量下的苯對造血系統有損害，而甲醛不同劑量組的脾臟、腎臟、卵巢系數的差異有統計學意義，提示卵巢可能是甲醛導致生殖損害的靶器官，結合中醫方面的補腎養血方治療卵巢儲備功能下降的臨床實踐[8]及建立早發性卵巢功能不全腎虛血瘀證的實驗動物模型[9]等相關文獻，提示甲醛對小鼠生殖損害的作用機制可能涉及因腎臟、脾臟功能不全導致的卵巢儲備功能下降，進而影響母鼠的生育力和胎仔的發育。

FSH和LH是反映卵巢儲備的重要指標，若卵巢儲備功能降低，FSH和FSH/LH比值會升高[10]，廣西壯族絕經婦女雌激素受體-β基因多態性與促卵泡刺激素、黃體生成素和雌孕激素的研究也證實α基因組的促卵泡刺激素、黃體生成素明顯下調，其臨床預后較好[11]，提示促卵泡刺激素與雌性生殖功能負相關。從FSH的變化可以看出，苯和甲醛單獨染毒對雌鼠血清FSH無主效應，苯和甲醛聯合染毒對雌鼠血清FSH有交互作用，表現為低劑量聯合組升高，高劑量聯合組降低，說明聯合染毒導致的毒效應不同與各毒物單獨染毒，低劑量組毒效應高于高劑量組。結合胎仔的胚胎毒性來看，甲醛不同劑量組的產仔數、活仔數、活仔重、4 d存活指數及4 d活仔重不同，低劑量甲醛組低于高劑量甲醛組，苯和甲醛聯合染毒時低劑量聯合組的4 d存活指數及4 d活仔重也低于高劑量聯合組。這一實驗結果與李輝等[12]的研究類似，與高劑量甲醛組相比，低劑量甲醛組的胚胎毒性更明顯；低劑量聯合時毒效應增大，高劑量聯合時毒效應相互抵消，4 d存活指數和4 d活仔重都有回升。

綜上，低濃度苯(12 mg/m3、60 mg/m3)和甲醛(2 mg/m3、10 mg/m3)聯合暴露對ICR小鼠的體重增長有影響，存在系統毒性，結合臟器系數的變化來看，可以推測該劑量下的暴露可導致卵巢等多種臟器的損傷。以往苯和甲醛生殖毒性研究多以雄性動物染毒或孕鼠胚胎植入期、器官形成期染毒，此次我們選擇卵泡發育期的ICR雌鼠為實驗對象進行呼吸道染毒，外推到人類即為育齡期的職業女工，多以呼吸道接觸毒物，又不能享受孕期和哺乳期女工的勞動待遇，而實驗結果顯示苯和甲醛低濃度、短時間的聯合暴露導致的雌性生殖損害既有主效應又有交互作用，提示目前苯與甲醛的職業接觸限值對職業女工的生殖健康存在一定風險。從動物實驗結果來看，甲醛的生殖損害更明顯，多個指標在甲醛不同劑量組有差異，苯和甲醛聯合染毒有交互作用，表現為低劑量聯合組的毒效應要高于高劑量聯合組，可能聯合染毒時苯的暴露對甲醛的毒效應存在抵消，但考慮到樣本量和實驗的穩定性，其交互作用具體為拮抗還是協同作用有待進一步研究。