基于輻射防護基因集預測的輻射損傷防護化合物活性評價

賈廣彥，劉禎，錢坤，周喆

1.軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京 100850；2.解放軍960醫院，山東 濟南 250031

輻射防護劑是防護與救治核輻射損傷最為有效和直接的手段之一[1]。隨著電離輻射應用領域的增加，輻射防護藥物需求也愈顯迫切。多年來，各國學者對人工合成化合物、天然化合物和生物因子在內的大量候選藥物進行了研究和篩選[2]，這些方法費時費力，在尋找高效低毒的輻射防護劑方面進展比較緩慢[3]。

老藥重利用（也稱藥物重定位）是基于已有的藥物發現其新用途，因對其毒副作用了解較為清楚，因此開發成功的概率更高，是新藥研發的有效手段之一[4]。計算預測分析和實驗篩選過程是老藥新用研究的兩大方法[5]。本單位多年來從事多組學數據的計算分析，以探尋已上市藥物新的適用范圍，為新藥研發提供新的思路方法。任磊[6-7]等利用轉錄組數據結合輻射損傷特征篩選輻射損傷防護候選藥物，并進行實驗驗證證明了巴氯芬、阿米洛利等藥物具有輻射損傷防護作用，為使用藥物重定位策略尋找有效的輻射損傷防護藥物提供了有力參考。為從上市藥物中發現輻射損傷防護劑，劉禎[8]等利用基于網絡的細胞反應印記整合文庫（LINCS）計劃[9]的小分子化合物刺激不同細胞系的轉錄譜數據，構建算法評估化合物的輻射損傷防護作用，預測出了299種可能具有輻射損傷防護作用的藥物。本研究對基于輻射防護基因集預測的系列化合物中排名靠前的結構進行了藥效學評價，發現了具有輻射損傷防護作用的藥物來那度胺，并進一步探討了其輻射損傷防護作用涉及的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性 C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，合格證號［SCXK（京）-2019-0010］。

來那度胺（lenalidomide）、醛脫氫酶-2激動劑（ALDA-1）、氨磷?。╓R2721）購自 MedChemExpress公司；全自動血細胞分析儀為北京寶靈曼陽光科技有限公司產品；倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產品。

1.2 30 d存活率實驗

我們在劉禎[8]等預測的299種抗輻射藥物中選擇了來那度胺和ALDA-1于動物模型上驗證其是否具有輻射損傷防護作用。C57BL/6J小鼠飼養于軍事醫學研究院SPF級動物房，相對濕度為50%±10%，12 h燈光12 h黑暗，喂常規飼料，自由飲水。實驗前3 d觀察有無異常。小鼠按體重隨機分為輻射對照（等容生理鹽水）組、WR2721（150 mg/kg）組（陽性對照）、來那度胺（200 mg/kg）組、ALDA-1（5 mg/kg）組，每組10只。2種藥物溶媒為分析純DMSO。每日腹腔注射給藥1次，給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線（軍事醫學研究院鈷源）對各組小鼠進行一次性全身照射，照射劑量8 Gy，照射劑量率為69.27 cGy/min。照射后30 d觀察各組小鼠生存情況。

1.3 外周血白細胞、血小板、淋巴細胞測定

由于來那度胺輻射損傷防護效果較好，后續實驗對其作用機制進行了研究。C57BL/6J小鼠按體重隨機分為輻射對照（等容生理鹽水）組、WR2721（150 mg/kg）組（陽性對照）、來那度胺（200 mg/kg）組，每組10只，每日腹腔注射給藥1次，給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線對各組小鼠進行一次性全身照射，照射劑量6.5 Gy，劑量率為68.33 cGy/min。另取10只同齡C57BL/6J小鼠作為正常組。

照射后第4、7、11、18、21 d照射各組與正常組小鼠尾靜脈取血20 μL，加入3%檸檬酸鈉2 μL抗凝后用全自動血細胞分析儀檢測白細胞、血小板和淋巴細胞數量。

1.4 骨髓病理分析

上述6.5 Gy60Co γ射線照射各組與正常組小鼠各2只于照后第14 d取股骨，剔除股骨附著的軟組織，置于4%多聚甲醛固定液中，16 h后常規脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色后在200倍顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。

1.5 數據統計

采用SPSS19.0軟件進行分析，白細胞、血小板、淋巴細胞數量以x±s表示，采用方差分析（One-Way ANOVA）或秩和檢驗。動物存活率采用生存分析Log Rank檢驗。

2 結果

2.1 來那度胺對輻射小鼠30 d生存率的影響

經8 Gy60Co γ射線照射后30 d，輻射對照組小鼠存活率為50%，ALDA-1和來那度胺組小鼠存活率為100%（圖1），說明預測結構來那度胺、ALDA-1在動物模型上具有較好的輻射損傷防護作用。后續實驗中我們針對來那度胺的輻射損傷防護機制進行研究。

圖1 來那度胺對致死劑量輻射損傷小鼠的保護作用

2.2 來那度胺對輻射損傷小鼠白細胞、血小板、淋巴細胞數量的影響

經6.5 Gy60Co γ射線照射后，各組小鼠的血液生化指標均顯著降低并且隨時間有不同程度的回升。與輻射對照組相比，來那度胺組和陽性對照組小鼠白細胞數量回升更早，照射后第11 d輻射對照組小鼠白細胞數量還在降低，而來那度胺組和陽性對照組已顯示出白細胞的恢復，照射后第21 d各組小鼠白細胞數量恢復至相近水平，以來那度胺組略優，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。來那度胺組和陽性對照組照射后淋巴細胞回升趨勢好于輻射對照組，相比差異顯著（P＜0.05）（表2）。在血小板回升過程中，來那度胺組和陽性對照組不僅回升趨勢好于輻射對照組，并且第21 d恢復程度也明顯優于輻射對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）?？梢妬砟嵌劝房蓽p少白細胞、血小板、淋巴細胞數量下降的程度，并有助于其恢復。

表1 來那度胺對輻射小鼠白細胞數量的影響

表2 來那度胺對輻射小鼠淋巴細胞百分比的影響

表3 來那度胺對輻射小鼠血小板數量的影響

2.3 來那度胺對輻射小鼠骨髓脂肪化和細胞增生的影響

HE染色切片（圖2）顯示，正常組小鼠股骨骨髓未見脂肪滴，細胞分裂活躍，細胞增生明顯，骨髓細胞排列緊密；輻射對照組小鼠骨髓重度脂肪滴化，內有重度出血，骨髓造血細胞缺乏，細胞增生不明顯，重度骨髓細胞耗竭；來那度胺組小鼠股骨骨髓輕度脂肪滴化，骨髓輕度出血，骨髓細胞增生，輕度骨髓細胞耗竭；WR2721組小鼠骨髓輕度脂肪滴化，骨髓內有輕度出血，骨髓細胞顯著增生。病理學觀察結果顯示來那度胺可減輕全身照射誘導的小鼠骨髓脂肪化，減少骨髓出血，促進骨髓增生，表明其輻射防護機制可能涉及保護小鼠造血系統，減輕造血組織的損傷。

圖2 來那度胺對輻射損傷小鼠骨髓組織形態的影響（HE×200）

3 討論

輻射損傷防護藥物在國防、反恐、和平利用原子能等方面都有很大價值[10]，經過近半世紀的努力，抗輻射損傷藥物研究已取得一些進展，有些藥物已應用于臨床，包括氨硫基類化合物、細胞因子類、激素類、天然藥物等[11]?，F有的輻射損傷防護作用藥物仍存在許多的問題，如多數防護藥物作用單一，無法滿足對中重度急性輻射損傷患者治療的需求[12]，有些藥物毒性低但防護效價低、有效時間短[13]，有些藥物防護效價較高但不良反應大[14]，因此尋找高效低毒的新型抗輻射藥物仍然具有重要意義。

藥物重定位是發掘已知藥物的新用途，探尋其新的適用范圍，由于基于已上市藥物，該策略可降低開發風險，研發效率高[15]。十幾年來，各類組學技術的蓬勃發展和廣泛應用[16]，積累了多組學、多層次的海量數據，使生物醫學進入大數據時代，大數據分析為發現新的藥物作用模式[17]、藥物作用機理辨識、藥物重定位[18]等提供了新的技術方法?；谳椛浞雷o基因集預測抗輻射藥物，是一種基于化合物或藥物基因表達譜發現已上市藥物新用途的方法。此模式基于臨床已經使用的藥物，其藥物作用特點研究比較充分。本研究對基于輻射防護基因集預測的抗輻射藥物的防護作用進行了驗證，篩選出具有抗輻射活性的結構來那度胺。來那度胺是第二代免疫調節劑，具有抗血管生成、改善免疫功能、腫瘤殺傷和改變骨髓微環境等多種作用機制，已上市多年，臨床上用于好幾種血液病的治療[19]。本研究發現其在動物模型上具有輻射損傷防護作用，提示其進一步研發為輻射防護劑的可能性。本研究也以實驗藥理學依據證明轉錄組數據在抗輻射藥物重定位研究中的有效性，為發現新型防輻射損傷化學結構提供了方法學參考。