miR-21與胃癌的關系

蘇利佳，蘇華華，王艷華，趙金映

三峽大學醫學院 形態學系，湖北 宜昌 443002

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，具有較強的侵襲性和轉移性，臨床確診時多數病情已進入晚期，預后極差[1]。尋找有益于胃癌早期確診的新途徑，將極大地改善胃癌患者的預后。其中，microRNA（miRNA）分子的結構及其在腫瘤進程中的功能引起了學者們廣泛關注。這些由19～25個核苷酸組成的小分子可通過與靶基因3′非翻譯區的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯而調控腫瘤細胞信號轉導，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、運動和侵襲中發揮重要作用[2-3]。

在這些miRNA分子中，miR-21參與胃癌的病理進程。miR-21定位于染色體17q23.2，緊鄰空泡膜蛋白 1（vacuole membrane protein 1，VMP1）基因，在核糖核酸內切酶RNaseⅢ作用下，miR-21的前體pre-miR-21被剪切成前導鏈miRNA-21-5p和后隨鏈miRNA-21-3p[4]。miR-21分子在胃癌組織和胃癌細胞系中呈高表達狀態，它能與多種靶基因，如富含AT的特異性序列結合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein-1，SATB1）、程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）、人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）、凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）、金屬蛋白酶抑制因子3（metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用，進而激活腫瘤增殖信號，促進腫瘤血管生成和腫瘤遷移[5]。此外，miR-21還可作為胃癌診斷標志物，用于評估胃癌的臨床分期、分級及預后[6]。在此，我們就miR-21分子作為胃癌標志物、與胃癌增殖轉移的關系，以及miR-21分子抑制劑研究進展做簡要總結，通過梳理miR-21與胃癌間的相互關系，為胃癌研究相關學者提供參考。

1 miR-21可作為胃癌標志物

先前研究已發現miRNA在結構上高度保守，穩定地存在于各種體液中，可以作為疾病的生物標志物[7]。并且miRNA廣泛存在于人體組織及體液中，各種疾病的不同狀態下miRNA的表達情況也不同，因此臨床醫生或科研人員可以通過檢測體液中的miRNA水平來診斷疾病和評估預后。Xu等[8]發現胃癌組織中miR-21-3p和miR-21-5p的表達均高于癌旁組織，在腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移階段，miR-21-3p和miR-21-5p均為高表達水平。miR-21-3p和miR-21-5p可作為胃癌診斷的潛在生物標志物，但在判斷胃癌Ⅱ或Ⅲ期TNM分期中，miR-21-5p在區分腫瘤分化程度方面更有優勢。

胃癌患者外周血中miR-21相對水平也顯著高于健康人群，可作為胃癌血清學篩查的分子標志物[9]。miR-21與各臨床病理特征均無相關性，但miR-21的高表達可影響胃癌的發生和患者的生存時間。如有學者選取胃癌患者50例，采集患者外周血標本，并以50例健康人作為對照，對比研究miR-21和miR-182基因在胃癌患者外周血和胃癌組織中的表達差異，結果發現胃癌患者外周血中miR-21和miR-182的相對表達水平明顯高于正常健康人，且miR-21和miR-182的高表達預示著患者的生存時間縮短。

miR-21表達水平與胃癌預后關系密切。Sierzega等[10]發現，miR-130a、miR-331、miR-19a、miR-223、miR-106a、miR-21和miR-374在原發性腫瘤中過表達。而Obermannova等[11]發現胃癌組織中miR-10b、miR-21、miR-93和miR-107的表達水平明顯高于非腫瘤組織，miR-10b、miR-21、miR-145表達升高與胃癌患者預后不良顯著相關。Emami等[12]采用Real time PCR檢測了30例胃癌患者和30例健康對照者血漿中miR-21和miR-222的表達水平，發現胃癌患者血漿中miR21和miR222的表達水平明顯高于對照組，因而他們認為外周血循環中miR-21和miR-222水平可以作為胃癌診斷標志物。

miR-21還可作為胃癌腹膜轉移的診斷標志物。臨床研究發現，超過一半以上的胃癌晚期患者在根治性切除術后發生腹膜轉移，是晚期胃癌患者死亡的首要原因之一[13]。Soeda等[14]研究了外泌體包裹的miRNA（ex-miRNA）在接受根治性手術的胃癌患者中作為微創生物標記物的有效性，發現miR-21與PDCD4的mRNA表達水平呈負相關，并且miR-92a與前列腺素E受體4的mRNA表達水平呈負相關。研究提示胃癌腹膜復發者與無腹膜復發者的ex-miR-21和ex-miR-92a水平有明顯差異，因此ex-miR-21和ex-miR-92a可能成為預測Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者腹膜復發和預后的有效的微創生物標志物。

miR-21參與PD-1/PD-L1通路介導的胃癌術后Th17/Treg細胞失衡。Zheng等[15]發現胃癌切除術后的患者Th17細胞減少，Treg細胞增多，PD-1/PD-L1表達增加；并且RORt和IL-17表達降低，而Foxp3和TGF-1表達升高。在體外實驗中，通過Ad-sh-PD1沉默PD-1可以促進miR-21的表達，增加Th17細胞百分比，降低Treg細胞百分比。因此，miR-21的過表達增加了Th17細胞百分比，降低了Treg細胞百分比。這表明miR-21參與PD-1/PD-L1通路介導的胃癌術后Th17/Treg細胞失衡，如能有效監測胃癌切除術后患者miR-21表達水平，維持Th17/Treg細胞平衡，可有效改善患者預后。然而，當前的研究仍存在實驗結果統計分析方法標準不統一，樣本量較小的問題。如果合理應用檢測手段監測其體內水平，即可將miR-21作為良好的胃癌診斷指標。

2 miR-21參與胃癌病理進程

研究發現，miR-21可負調控Smad7基因，促進胃癌細胞增殖和轉移[16]。而Smad7是Smad家族成員，屬于TGF-β超家族配體，參與細胞信號轉導，發揮抑癌因子的作用。Smad7可以通過阻止Smad2/Smad4復合物的形成來阻斷TGF-β信號的形成。Jiang等[17]研究表明Smad7在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達水平降低，而敲除miR-21-5p基因后，Smad7基因表達上調，且SGC-7901細胞的增殖能力顯著下降。另一項有關胃癌腹膜轉移的研究也發現，外泌體miR-21-5p可以靶向下調Smad7的表達，從而誘導HMRSV5細胞的間皮-間充質轉化（mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT），促進胃癌的腹膜轉移[18]。Xiao等[19]研究發現，用miR-21模擬物轉染MGC-803細胞后，miR-21的表達上調可促進上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進展。然而，轉染miRNA-21抑制劑后E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達增多，胃癌細胞的EMT受到抑制。因此推測，在胃癌中miR-21的過表達可以通過沉默Smad7促進TGF-β途徑，從而啟動MMT，也可通過EMT影響胃癌細胞的遷移能力。

miR-21-5p促進胃癌的能量代謝[20]。Liu等[21]研究發現miR-21-5p在胃癌組織中顯著上調，PDHA1在胃癌中的表達明顯下調，兩者表達程度為負相關。轉染miR-21-5p模擬物的胃癌細胞乳酸產生增加，而轉染其抑制劑的細胞乳酸產生減少，以上結果提示miR-21在胃癌中可能通過促進糖酵解，使胃癌細胞乳酸增加，具有促癌作用。進一步研究兩者的關系發現，miR-21-5p能促進空白對照細胞的糖酵解，但不能促進PDHA1過表達細胞的糖酵解。而在抑制PDHA1表達的細胞中，miR-21-5p未能進一步增加糖酵解水平，說明miR-21-5p可以通過靶向調控PDHA1進而調節糖酵解，并且PDHA1的下調會促進胃癌糖酵解和從而影響胃癌的增殖分化。因此，通過調控miR-21-5p/PDHA1軸可以影響胃癌的糖酵解和進展過程是可行的。

miR-21參與激活胃癌增殖轉移信號轉導。Zhou等[22]發現沉默miR-21顯著抑制了胃癌細胞的遷移和運動，這可能與波形蛋白的表達下調有關。研究還發現miR-21的下調促進了細胞凋亡，使細胞周期停滯于G0/G1期。進一步的研究表明，miR-21的下調使PTEN蛋白表達增加，但PTEN mRNA的表達無明顯變化，進而降低了胃癌細胞中Akt的磷酸化。因此，miR-21可以通過調控PTEN/Akt信號通路來影響人胃癌細胞的增殖、運動和凋亡，有望成為治療胃癌的靶點。

綜上所述，miR-21可通過下調Smad7、PTEN、PDHA1信號，激活EMT進程，促進胃癌惡性發展。

3 抑制miR-21的相關研究

干擾或抑制miR-21信號的途徑有miRNA抑制劑，病毒介導的pre-miRNA、sh-pre-miRNA，干細胞分泌的外泌體，以及人工包裝miRNA的外泌體[23]。miRNA抑制劑在治療腫瘤疾病中具有以下優勢：首先，miRNA易穿過細胞膜；其次，由于缺少polyA尾，miRNA不具有免疫原性，不引發機體的免疫反應；第三，這些分子在體外和體內都相當穩定，可以通過對它們的進一步修飾以延長其生物半衰期。因此，有效開發miR-21抑制劑成為當前研究的熱點。除了通過抑制miR-21表達激活PTEN/PI3K/mTOR信號軸外[24]，抑制miR-21分子功能的途徑還有以下3種方式。

3.1 受體蛋白相關抑制作用

FZD6（frizzled6）是卷曲基因家族的一員，是非典型的Wnt信號蛋白的受體。越來越多的證據表明，FZD6參與了腫瘤的發生發展，是腫瘤細胞體外增殖和遷移的重要調控因子[25]。Yan等[26]發現FZD6的過表達可以靶向抑制miR-21的促癌作用，與典型和非典型Wnt途徑中miR-21依賴的效應相關。另外發現，FZD6在胃癌組織和胃癌細胞系SGC7901、AGS中的表達較正常胃組織和正常胃上皮細胞系GES-1下調。而集落形成實驗顯示，促進FZD6表達可顯著抑制腫瘤生長，Transwell實驗還發現FZD6的表達上調可顯著抑制胃癌細胞的遷移能力。而轉染si-FZD6的胃癌細胞與轉染si-Control的細胞相比，表現出更強的細胞增殖和遷移能力。FZD6通過激活非典型的Wnt途徑來抑制胃癌細胞的增殖和遷移。因此，FZD6具有靶向miR-21來抑制胃癌細胞增殖和遷移的作用。

3.2 環狀RNA相關抑制作用

circHIAT1是一種重要的具有潛在抗腫瘤功能的環狀RNA（circRNA），已被證明在腎癌中具有腫瘤抑制作用。Quan等[27]發現circHIAT1可以抑制miR-21在胃癌中的促癌作用，胃癌組織中circHIAT1的表達明顯低于癌旁組織。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）作為一種有絲分裂原活化的蛋白激酶通路，與胃癌細胞的生長和分化有關。PLCDH-circHIAT1轉染MKN28和MKN45細胞后，細胞存活率下降，p53、p21表達水平升高，細胞凋亡。PI3K/AKT是經典的生存信號轉導途徑，調節著許多生物學過程，如增殖和凋亡。AKT通路在胃癌中經常被激活以促進胃癌細胞的生長，而PTEN通過抑制PI3K負向調節AKT通路。circHIAT1可以通過使miR-21表達下調來抑制胃癌細胞的增殖和EMT，并且抑制PTEN/PI3K/AKT和ERK信號通路發揮抗腫瘤作用。

3.3 lncRNA相關抑制作用

研究發現，在miRNA上長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與mRNA有著共同結合位點，lncRNA可通過結合相應的結合位點吸附miRNA，作為內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA競爭性結合，消除miRNA的下游效應[28]。Li等[29]發現lncRNA生長特異抑制物5（growth arrest-specific 5，Gas5）在胃癌組織和細胞中低表達，miR-21在胃癌組織和細胞中高表達。與正常胃黏膜上皮細胞相比，胃癌細胞MKN45、MKN7和SGC-7901中Gas5的表達明顯下調，miR-21的表達明顯上調。雙重螢光素酶報告顯示miR-21降低了含有野生型3′非翻譯區的Gas5的螢光素酶活性，但沒有降低含有突變型3′非翻譯區的Gas5的螢光素酶活性，這表明miR-21是MKN45細胞中Gas5的靶基因。Gas5的過表達和miR-21的抑制顯著抑制了MKN45的增殖、遷移和侵襲，促進了胃癌細胞的凋亡，Gas5過表達和miR-21抑制顯著降低Bcl-2蛋白表達，增加Bax和Caspase-3蛋白表達，進而降低了胃癌細胞的耐藥性，促進了胃癌細胞的凋亡。Gas5轉染胃癌細胞后，miR-21的表達明顯降低，胃癌細胞的遷移受到明顯抑制，體內實驗結果與體外實驗結果一致。因此，過表達Gas5靶向抑制miR-21表達，顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和成瘤，促進胃癌細胞凋亡。

母體表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是一種lncRNA，也是一種抑癌因子，在多種腫瘤組織中表達下調。Xu等[30]通過qRTPCR檢測發現胃癌組織和細胞系中MEG3表達下調，miR-21表達上調，miR-21的表達受MEG3的負調控?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一類功能相關的含鋅酶家族，能降解細胞外基質促進細胞侵襲。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成中起重要作用，促進內皮細胞增殖、遷移和侵襲。研究發現，轉染lncRNA-MEG3的胃癌細胞與對照組相比細胞間接觸更為緊密。MEG3的過表達降低了MMP-3、MMP-9和VEGF的表達，抑制胃癌細胞的EMT。MEG3過表達還使上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白的表達上調，間質細胞標志物N-鈣黏蛋白、Snail蛋白和β-連環蛋白的表達下調來抑制EMT，使胃癌細胞遷移能力下降，而miR-21的過表達通過激活EMT促進AGS的細胞遷移。共轉染lncRNA-MEG3和miR-21模擬物可拮抗MEG3對細胞遷移的抑制作用。因此，MEG3/miR-21軸通過抑制胃癌EMT而影響胃癌細胞的遷移能力。

有關抑制miR-21表達的上游調控分子總結于表1，然而當前研究尚存在一些問題：如實驗中僅僅只關注了單個或幾個miRNA水平的變化，并未反映整體水平的變化規律；又如一些miR-21抑制劑靶向特異性不高或存在脫靶問題，從而造成不良后果。但無論如何，研究針對miR-21的新藥物，發現抑制miR-21的新靶點或新途徑，未來應用于胃癌預防和治療的前景廣闊。

表1 抑制miR-21表達的上游調控分子

4 結語

miR-21分子與胃癌關系密切，它可通過多種途徑促進腫瘤的進展。miR-21可作為胃癌早期診斷和預測術后復發的重要指標。通過抑制miR-21分子功能而抑制胃癌進展的研究取得了一定成果，但存在病例樣本數過少、體內模擬實驗缺乏等問題，使miR-21分子在胃癌病理進程中的作用機制探討稍顯不足，尤其是各個調控通路的相關性和級聯性還未被完全發掘。相信隨著醫學技術的進步和機制研究的深入，miR-21分子及其抑制劑應用于胃癌早期診斷和治療的春天即將到來。