酶法水解脫脂乳及其對嗜熱鏈球菌增殖效果研究

杜永新，段玉霞，馬萬平，趙世偉，楊子彪

（云南皇氏來思爾乳業有限公司，云南大理 671003）

0 引言

脫脂乳（Skimmed milk powder，SMP） 是鮮乳通過物理方法將脂肪經高速離心機脫去，再經過濃縮、噴霧干燥而制成，其脂肪含量較低（≤2.0%），蛋白質含量高（≥32%）；按照加工方式可分為低熱脫脂乳、中熱脫脂乳、高熱脫脂乳等[1]。脫脂奶粉主要用作加工其他食品的原料，或是特殊營養需要的消費者食用[2]，其含有優質的氮源、碳源、維生素及微量元素等[3]，適合乳酸菌生長，但其凝乳性導致菌體不易被收集，很少用于工業發酵劑的制備。隨著蛋白酶制備技術的成熟，脫脂乳酶解液開始用于乳酸菌的培養，以脫脂乳酶解液作為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌基礎培養基，其活菌數比脫脂乳高，且利用此培養基得到的凍干發酵劑質量也較好[4]。蛋白酶解物不僅能促進乳酸菌的增殖[5]，還能提高乳酸菌長期保存時的生存能力[6]，且添加在發酵制品中能夠增強產品的穩定性和風味；脫脂乳酶解液培養出的乳酸菌具有安全性高、活菌數高、菌體易收集、抑菌性能強[7]等優點，故成為研究的熱點。

通過研究影響脫脂乳乳蛋白酶解的工藝因素（包括酶解時間、加酶量、反應溫度、起始pH 值），以促進乳酸菌增殖為出發點探究酶解脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017- a 的作用，進一步擴大脫脂乳粉的利用，以期為乳酸菌發酵劑的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

脫脂乳粉、WPC80，產自新西蘭；嗜熱鏈球菌，自分離菌株，云南皇氏來思爾乳業有限公司提供；中性蛋白酶（食品級，50 000 U/g）、L-Cysteine HCl，北京索萊寶科技有限公司提供；氫氧化鈉（國產分析純），天津市大茂化學試劑廠提供；酵母粉，安琪酵母股份有限公司提供；牛肉膏、魚蛋白胨、胰蛋白胨，北京陸橋技術股份有限公司提供；蔗糖（國產分析純），江蘇強盛功能化學股份有限公司提供；葡萄糖、乳糖、MgSO4·7H2O、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為國產分析純，天津市大茂化學試劑廠提供。

1.2 培養基

M17，參考張曉蕾[8]的方法配制。

改良M17 培養基（1 000 mL 用量）：牛肉膏15 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖5 g，魚蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 250 mg，蔗糖5 g，L-Cysteine HCl＊110 mg，WPC 80＊20.5%，黃瓜汁＊310%，磷酸氫二鈉0.02 mol/L，磷酸二氫鈉0.02 mol/L（備注：*1，*2 采用0.22 μm 無菌濾器過濾；*3 黃瓜汁的制備：選購新鮮的黃瓜，清洗、切片、稱重，然后加水打漿，紗布過濾，于115 ℃下滅菌15 min，冷卻后備用。）

按上述要求準確稱取各組分，用去離子水定量到1 000 mL，于121 ℃下滅菌15 min；M17 瓊脂糖培養基配制：在M17 液體培養基組分基礎上加入技術瓊脂粉12 g，于121 ℃下滅菌15 min。

1.3 試驗設備

恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；分析天平，上海越平科學儀器有限公司產品；冰箱，青島海爾股份有限公司產品；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；pH 計，METTLER TOLEDO 公司產品；CX41 型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化和培養

凍干菌種在M17 中于38 ℃下活化2 代，待形態恢復正常后，于4 ℃下保藏，備用。

以2%（V/V） 的接種量將活化后的菌株轉接至不同水解脫脂乳培養液中，于38 ℃下恒溫發酵24 h，發酵過程及發酵結束后測定相關指標。

1.4.2 脫脂乳水解液的制備

（1） 稱量。準確稱取脫脂乳粉12 g。

（2） 加熱。100 mL ddH2O 加熱至55～60 ℃。

（3） 溶解。將稱量好的脫脂乳粉溶于ddH2O。

（4） 定量。測定上述溶液蛋白含量，控制在3.5%～3.7%。

（5） 調pH 值。將上述定量后溶解pH 值調至7.0。

（6） 稱量。稱取中性蛋白酶，加酶量為120 U/mL。

（7） 溶解。將中性蛋白酶加入上述溶液中，充分溶解混勻。

（8） 酶解。55 ℃下酶解，酶解過程中用0.5 mol/L NaOH 中和酶解液。

（9） 滅菌（酶）。溫度115 ℃，時間10 min，滅菌結束快速冷卻。

（10） 調pH 值。將體系pH 值調至7.0。

（11） 保存。室溫或冷藏條件下保存備用。水解度計算公式：

式中：B——NaOH 體積，mL；

Mb——NaOH 濃度，mol/L；

α——氨基酸平均解離度，酪蛋白的1/α 為2.26；

Mp——蛋白質質量，g；

Htot——對于酪蛋白，取值為8.2 mmol/g[9]。

1.4.3 活菌數測定

活菌數測定參照GB 4789.35—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》 的方法進行[10]。

1.4.4 試驗設計

影響脫脂乳水解反應的主要因素有酶解溫度、起始pH 值、加酶量和酶解時間。首先進行單因素試驗，在單因素試驗結果基礎上，以正交試驗設計優化中性蛋白酶對脫脂乳的酶解條件。以加酶量（A）、起始pH 值（B）、酶解溫度（C） 和酶解時間（D）進行正交試驗設計。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.4.5 不同培養基對嗜熱鏈球菌促生長對照試驗

凍干菌活化2 代，按2%接菌量分別接種于脫脂乳酶解液培養基、M17 培養基和M17 改良培養基中，于38 ℃下恒溫發酵24 h，發酵結束參照GB 4789.35—2016 法測定活菌數。

1.4.6 數據處理

采用Graphpad prism7 軟件對數據進行統計分析，每組試驗均重復3 次，并做3 個平行樣。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度對水解度的影響

酶催化底物反應的速度和酶的穩定性均受到酶解溫度的影響。通常情況下，由于反應底物的不同，中性蛋白酶對其最適酶解溫度也有所不同。參照說明書，中性蛋白酶的最佳酶解溫度為30～60 ℃，其最佳酶解pH 值5.5～7.5。為探究酶解溫度對中性蛋白酶酶解乳蛋白的影響，設定起始pH 值7.0，加酶量120 U/mL，酶解時間3.0 h，最終以水解度作為指標，探究不同酶解溫度對脫脂乳乳蛋白水解度的影響規律。

酶解溫度對水解度的影響見圖1。

由圖1 可知，水解度隨著酶解溫度的升高而升高。在40～50 ℃內水解度較在50～60 ℃反應溫度內上升慢，造成此現象主要原因是：在適宜的反應溫度下，隨著反應溫度的升高，加聚了反應物分子間的接觸，使得反應更為劇烈；在50～60 ℃內，中性蛋白酶酶活性較強，在同等條件下其反應速度就較其他反應溫度下降快。結果表明，中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白其反應溫度在60 ℃時效果最好，由于脫脂乳粉中含有還原糖，經酶解后的產物中含有大量氨基化合物，在適宜條件下會發生美德拉反應，使酶解物顏色加深，并且在一定范圍內溫度對美德拉反應有正促進作用。為避免美拉德反應對酶解物的影響，所以選定55 ℃最為酶解溫度。

2.2 起始pH 值對水解度的影響

由上述結果可知，中性蛋白酶在55 ℃時綜合效果較佳；在加酶量120 U/mL，酶解時間3.0 h，酶解溫度55 ℃條件下，探究不同起始pH 值對水解度的影響。

起始pH 值對水解度的影響見圖2。

由圖2 可知，中性蛋白酶的pH 值為6.0 時水解度較低；起始pH 值在6.0～7.5 內，水解度隨起始pH值的增加而加快；當起始pH 值超過7.5 時，水解度開始下降，并且水解液的顏色也隨之加深。由于在測定水解度過程中添加NaOH，反應過程會產生的鹽，會使溶液滲透壓增大，不利于菌體生長，綜合考慮選定起始pH 值7.5 作為最佳起始pH 值。

2.3 酶解時間對水解度的影響

由上述試驗確定的結果，設定酶解溫度55 ℃，起始pH 值7.5，在加酶量120 U/mL 下探究不同酶解時間對脫脂乳乳蛋白酶解度的影響。

酶解時間對水解度的影響見圖3。

由圖3 可知，在上述優化酶解條件下，隨著時間的增加，水解度呈現先增大后減小的趨勢。在酶解時間開始2 h 內，水解度增加趨勢較2～3 h 內較慢；水解3 h 后水解度呈現下降的趨勢；在酶解反應開始2 h 內底物濃度較高，在其最適宜反應溫度和起始pH 值條件下，酶與底物濃度比高，酶活力高，反應較快；隨著酶解時間的增加，在2～3 h 時，酶與底物濃度雖然下降，但酶活力達到最高，酶解效率最佳；在3 h 后酶與底物濃度比降低，反應也隨之降低。為在短時間內達到最佳酶解效果，最終選定3 h作為酶解時間。

2.4 中性蛋白酶添加量對水解度的影響

由上述試驗確定的結果，設定酶解溫度55 ℃，起始pH 值7.5，酶解時間3 h，在加酶量分別為60，120，180，240，300 U/mL 下探究不同加酶量對水解度的影響。

加酶量對水解度的影響見圖4。

在整個酶解過程中由于底物蛋白的量是充足的，酶的添加量決定了酶與底物濃度比，故酶的添加量可以準確地反映酶的反應速率。由圖4 可知，加酶量為120～180 U/mL 時，酶的反應速率增加較快；添加酶量超過180 U/mL 后，酶解度速緩慢。綜合考慮水解度和生產成本，選定加酶量為180 U/mL。

2.5 脫脂乳乳蛋白酶解條件優化

試驗確定了最佳單因素影響條件，在上述試驗結果基礎上對加酶量、起始pH 值、酶解溫度和水解時間進行L9（34）正交試驗，以確定中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白的最佳工藝參數組合。

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

對上述結果進行分析可知，影響脫脂乳乳蛋白水解度的因素主次關系依次為加酶量＞起始pH 值＞酶解溫度＞酶解時間。在整個酶解過程中，底物蛋白是絕對夠量的，也就是說乳蛋白的酶解程度主要取決于酶的添加量，其次是起始pH 值，最后是酶解溫度和酶解時間。由試驗結果和正交分析可知，乳蛋白最佳酶解條件組合為A3B1C2D1，所以最終選定酶解脫脂乳乳蛋白工藝為中性蛋白酶添加量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解時間2 h。

2.6 不同水解度脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用情況

經酶解后的脫脂乳富含大量的生物活性物質，可促進益生菌的生長。為探究酶解脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用，以便于生產應用，分別將脫脂乳在優化酶解條件下分別酶解時間0.5，1.0，1.5，2.0 h，水解結束經滅菌（酶） 處理作為培養基，同時以不同培養基為參照，以活菌數作為指標，驗證脫脂乳水解物對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用，試驗結果如下。

不同水解度脫脂乳對2017-a 促生長作用情況見圖5，不同培養基對嗜熱鏈球菌2017-a 促生長作用情況見圖6。

上述結果表明，脫脂乳經中性蛋白酶酶解后其酶解物對嗜熱鏈球菌2017-a 的生長有促進作用，水解度不同促生長作用情況不同，在最優酶解條件下獲得的酶解物促生長作用效果最佳，嗜熱鏈球菌2017-a的菌落總數可達2.30×109CFU/mL，較市售M17 培養基其活菌數提高一個數量級（1.7×108CFU/mL）；結果表明，脫脂乳中性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌2017-a 有明顯的促生長作用。脫脂乳中含有豐富的乳清蛋白和酪蛋白，乳清蛋白酶解物可以增加溶解性，對成泡、凝集、乳化能力的改變有促進作用，獲得的酶解乳清蛋白多肽具有抗高血壓、降低嬰兒配方奶粉過敏性等功能和生物特性[11]；其酪蛋白酶解物則具有促進凝結、抗過敏、抗血栓形成、促進礦物質吸收、調節胃腸吸收、抑制病原菌等多種功能，乳酸菌分解蛋白能力較弱，將富含氨基酸、寡肽的乳蛋白酶解物應用于菌體培養是能夠實現乳酸菌快速增殖和發酵[12-14]。

2.7 脫脂乳酶解物發酵劑穩定性

為驗證脫脂乳水解物穩定性，將制備的酶解物經滅菌（酶） 處理后，分別置于室溫和冷藏條件下，測定其pH 值、無菌檢測等相關性能；并將菌株轉接至水解物中，制得發酵劑，并測定發酵劑相關性能，試驗結果如下。

酶解脫脂乳培養基在不同貯藏條件下pH 值變化見圖7，酶解脫脂乳發酵劑pH 值變化情況見圖8，酶解脫脂乳發酵劑在4 ℃冷藏條件下活菌數變化情況見圖9。

上述試驗結果表明，制備的脫脂乳酶解物在室溫和冷藏條件下較為穩定，在保藏期間其組織狀態未發生改變，無菌檢測結果顯示，在保藏期間無菌落生長；用酶解物制備發酵劑，其穩定性良好，在冷藏前期菌體繼續生長，其活菌數最高可達2.84×109CFU/mL；酶解脫脂乳發酵劑性能測定結果顯示可以將其作為理想的備用生產發酵劑。

3 結論

中性蛋白酶酶解脫脂乳的最佳工藝條件為加酶量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解時間2 h，在此條件下脫脂乳乳蛋白水解度可達22.1%。在最優酶解條件下獲得的脫脂乳酶解物促生長效果最好，嗜熱鏈球菌2017-a 的菌落總數可達2.30×109CFU/mL，較商業M17 培養基其活菌數提高一個數量級，制得的脫脂乳酶解物穩定性良好，為生產發酵劑的制備提供了理論基礎。