桃MPK3基因的克隆、表達及生物信息學分析

程 寧 冀美玲 張澤杰 李 玲 高東升

(山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安 271018)

近年來,隨著設施果樹栽培的迅猛發展,桃樹已成為保護地栽培的主要樹種之一,其栽培面積不斷擴大。溫帶落葉果樹存在休眠機制,在此期間完成營養物質貯藏以及花芽的進一步分化,從而抵御冬季不適宜生長的環境[1-2]。采取適當措施提早打破休眠,促進果樹開花結果,已成為當前設施果樹栽培的一項關鍵技術[3]。芽休眠受到外部環境、基因等多種因素的調控,涉及一系列的植物內部生理生化的動態變化以及信號轉導[4]。目前已有關于蘋果[5-6]、梨[7-8]、葡萄[9]、桃[3,10-11]等樹種芽休眠的相關研究報道,且不同樹種之間的休眠機理可能存在差異。

研究表明,無論是自然休眠還是環境調控引起的休眠,均是通過影響激素的合成和運輸來調控休眠的[12]。激素是植物大部分生命活動的重要調控因子,休眠進程也受激素水平的影響,與芽休眠關系最密切的激素是脫落酸(abscisic acid,ABA),其次是赤霉素(gibberellin,GA),ABA 能夠抑制芽萌發,GA 能夠促進芽生長,芽生長促進物質與萌發抑制物質的動態平衡決定了果樹芽的自然休眠狀態[2]。段成國等[1]研究表明,ABA 作為調控種子休眠、芽休眠的重要植物激素,其在花芽組織內的含量變化決定著休眠進程。

前人研究表明,在二穗短柄草[13]、辣椒[14]、煙草[15]、擬南芥[16]等物種的MAPK級聯反應途徑激酶基因啟動子序列中存在大量的脅迫應答元件和激素應答元件,能夠響應激素信號,并通過激素應答非生物脅迫。經證實,MAPK級聯途徑由3種蛋白激酶組成:MAPK 激酶之激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK/MEKK)、MAPK 激酶(mitogen activated protein kinase kinase,MAPKK/MKK)以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK/MPK)[17]。

目前關于MAPKs基因的研究主要集中在非生物脅迫信號傳遞[18]、植物激素響應以及信號轉導[19-20]、活性氧[21]等方面,而鮮見關于休眠的研究。本試驗擬通過生物信息學分析、亞細胞定位以及實時熒光定量等方法研究MPK3對激素調控的響應以及在芽休眠解除過程中的表達模式,以期為進一步探明MPK3 在植物休眠中作用機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于山東農業大學溫室大棚內的中油四號油桃(Prunus persicavar.nectarinaMaximZhongyousihao)為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理枝條 2017年11月中旬,采用隨機取樣的方法獲得一年生枝條100 根,預培養1 d(清水,溫度為24.5℃,光照強度為40 μmol·m-2·s-1,光周期為光照12 h/黑暗12 h,相對空氣濕度為80%)。處理組:0.5%Trtion 100+125 mg·L-1GA3溶液水培;空白對照(CK):0.5% Trtion 100 溶液水培。分別在處理0.5、1、3、5、7 d時隨機采集花芽,立即用液氮速凍,-80℃保存備用。

1.2.2 采集花芽和葉芽 從2017年12月10日扣棚(休眠解除期開始)至2018年2月7號開花(休眠解除),根據天氣情況每隔15 d 左右,隨機采集花芽和葉芽,立即用液氮速凍,-80℃保存備用。

1.2.3 生物信息學分析 利用Plantcare 在線軟件進行啟動子分析;利用GSDS 在線軟件進行內含子分析;采用DNAstar軟件對序列進行開放閱讀框查詢并預測氨基酸序列;利用在線軟件ProtParam 計算蛋白質分子質量和等電點;利用在線軟件Signal P 進行蛋白信號肽預測;利用NetPhos 2.0 Server和DictyOGlyc 1.1 Server軟件預測蛋白質修飾方式[22];利用在線軟件SOPMA 預測蛋白質二級結構[22];利用NCBI 數據庫中BLAST 進行同源蛋白基因的檢索;利用DNAMAN軟件進行同源蛋白序列的比對;利用MEGA5.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹。

1.2.4 總RNA的提取及實時熒光定量表達 根據桃基因組公布的MPK3 CDS 序列設計特異性引物(表1),PCR 擴增的模板為桃花芽cDNA。分別將樣品在液氮中充分研磨,參照冀美玲等[23]的方法,提取總RNA、反轉錄合成cDNA;根據杜培勇等[24]的方法設計熒光定量引物(表1)、進行實時熒光定量PCR,最后采用2-ΔΔCT[24]進行定 量數據分析,利 用GraphPad Prism 6 整理數據并制圖[25]。

表1 所用引物信息Table1 Information of primer sequences

1.2.5 亞細胞定位 亞細胞定位參照萬千等[26]的方法,將攜PpMPK3-GFP 融合蛋白表達載體的農桿菌GV3101 滲透培養液注射到煙草葉片中,48 h后撕取下表皮細胞,用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚,4′,6-diamidino-2-phenylindole)對細胞核進行染色、壓片,通過ZEISS 超高分辨率激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss Jena,德國)觀察綠色熒光蛋白信號。

圖1 GA 處理后芽的形態Fig.1 The morphology of the buds after GA treatment

2 結果與分析

2.1 MAKPs基因在GA 誘導下的表達分析

由圖1可知,與CK相比,中油四號油桃離體枝條外施GA3促進了其休眠解除,其花芽葉芽發育提前,處理7 d后,處理較CK 變化明顯,芽發育飽滿,體積增大,有明顯的萌發跡象。

由圖2可知,枝條外施一定濃度GA后,隨著處理時間的增加,芽中PpMPK1、PpMPK2、PpMPK3、PpMPK7、PpMPK9、PpMPK11、PpMPK14、PpMPK15的相對表達量均呈增加的趨勢,PpMPK9和PpMPK3 有相似的表達規律,分別比處理初期增長約10倍和30倍,特別是PpMPK3表達上調幅度最高,遠高于其他基因,表明后期試驗可以PpMPK3為切入點;PpMPK12的相對表達量有所下降,PpMPK5、PpMPK15 相對表達量整體變化不明顯。由圖3可知,清水培養枝條的花芽中的PpMPK3的相對表達量在7 d 內無顯著變化。推斷外施GA3可促進休眠解除期芽內PpMPK3的表達,提高PpMPK3的表達量,表現為正調控。

圖2 GA 處理后芽內MAPKs基因的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of MAPKs in the buds after GA treatment

圖3 空百對照組芽內PpMAPK3基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of PpMAPK3 in the buds of blank control group

2.2 PpMPK3基因全長cDNA 克隆與基因結構分析

以中油四號油桃油桃花芽cDNA為模板,利用特異性引物擴增出目的基因片段,通過膠回收,測序結果片段長度為1 113 bp,與目的基因一致,命名為PpMPK3(基因登錄號:XP_007205387.1)(圖4)。

圖4 桃PpMPK3基因的克隆Fig.4 Cloning of PpMPK3 gene in peach

對PpMPK3 進行啟動子預測,結果顯示,PpMPK3的啟動子內不僅包含CAAT-BOX和TATA-BOX 等啟動子必需的核心元件,還包含很多與脅迫相關的順式作用元件,如ABRE、LTR、MYB、WRE3 等,其中包括與赤霉素調控有關的GARE-motif。通過對PpMPK3 啟動子的序列分析,推測PpMPK3的啟動子可能是1個受赤霉素調控的啟動子。通過內含子分析發現,PpMPK3 有5個內含子,長度分別為97、245、120、223、120 bp,5′-UTR 長度為170 bp,3′-UTR 長度為438 bp(圖5),其編碼370個氨基酸,組成蛋白質分子量約為42.6 kD,理論等電點為5.62,原子總數為5 975,不穩定指數為41.58,親水性系數為-0.310,表明其屬于不穩定親水性蛋白。

圖5 PpMPK3的基因結構分析Fig.5 Genetic structure analysis of PpMPK3 gene

2.3 PpMPK3 蛋白的生物活性分析與結構預測

磷酸化和糖基化是蛋白質常見的修飾方式。通過NetPhos 2.0 Server軟件預測發現PpMPK3 蛋白發生磷酸化修飾的位點有45個。其中,絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點數量均為15個。磷酸化位點分布大致分為5個部分,分別是0～60、110～160、180～230、250～270和300～350 bp(圖6)。利用DictyOGlyc 1.1 Server軟件預測發現,PpMPK3 蛋白不存在糖基化位點(圖7)。

PpMPK3 蛋白信號肽的預測結果顯示,該蛋白的Y值為69,C值為22,二者數值均不高,且分值曲線不典型,預測該蛋白不存在信號肽。PpMPK3 蛋白的二級結構預測結果顯示,該蛋白由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈組成,其中α-螺旋占41.35%,延伸鏈占10.54%,無規則卷曲占48.11%。

圖6 桃PpMPK3 蛋白氨基酸翻譯后磷酸化修飾位點預測Fig.6 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of peach PpMPK3 protein

2.4 PpMPK3 同源序列比對和進化樹分析

圖7 PpMPK3 蛋白氨基酸翻譯后O-糖基化修飾位點預測Fig.7 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequences of PpMPK3 protein

利用NCBI BLAST 檢索PpMPK3的氨基酸同源序列,在DNAMAN軟件上進行氨基酸同源性比對。由圖8可知,桃PpMPK3與甜櫻桃(Prunus avium,XP _021809182.1)、蘋果 (Malus domestica,XP _008385257.1)、可可(Theobroma cacao,EOY34273.1)、陸地棉(Gossypium hirsutum,NP_001314498.1)、白樺(Betula platyphylla,AHY02158.1)、黃瓜(Cucumis sativus,NP_001267653.1)、胡楊(Populus euphratica,XP_011025025.1)、擬南芥(Arabidopsis thaliana,NP_190150.1)、番 茄 (Solanum lycopersicum,NP _001234360.1) MPK3 氨基酸序列相似性分別為99.73%、95.95%、89.87%、89.33%、88.03%、87.60%、86.49%、83.78%、83.65%。

比較不同物種間的親緣關系發現(圖9),PpMPK3蛋白與甜櫻桃(Prunus avium,XP_021809182.1)和蘋果(Malus domestica,XP_008385257.1)聚為一類,親緣關系最近;與擬南芥(Arabidopsis thaliana,NP _190150.1)、歐洲油菜(Brassica napus,NP _001303218.1)、蘿卜(Raphanus sativus,XP _018436502.1)的親緣關系次之,與白樺(Betula platyphylla,AHY02158.1)、可可(Theobroma cacao,EOY34273.1)、陸地棉(Gossypium hirsutum,NP _001314498.1)等親緣關系較遠。

2.5 亞細胞定位

為確認MAPK基因在細胞中表達的位置,將GFP與PpMPK3 融合后,進行煙草瞬時表達,利用DAPI對下表皮細胞染色,壓片,使用ZEISS 超高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀測,發現細胞核是PpMPK3 主要的分布位置(圖10)。

2.6 休眠解除過程中PpMPK3的表達分析

由圖11可知,2017年12月10日(休眠解除開始)至2018年2月7日(開花)期間,葉芽中PpMPK3的相對表達量總體呈先升高后降低的趨勢,2018年1月27日葉芽中PpMPK3的表達量大約是2017年12月10日的5.6倍。此期間,花芽中PpMPK3的相對表達量也呈先升高后降低的趨勢,2018年1月16日(花芽休眠解除)PpMPK3 相對表達量達到最高,為2017年12月10日的4.39倍,之后PpMPK3的相對表達量開始下降,逐漸恢復到初始水平?；ㄑ亢腿~芽中PpMPK3 相對表達量變化與休眠解除過程保持一致,相對表達量最高的時期在花芽和葉芽中有所不同,葉芽中PpMPK3 相對表達量在1月27日達到最高,比花芽中的最高表達推遲了11 d,同樣符合桃先開花后長葉的自然生長規律,由此判斷,PpMPK3基因參與了調控花芽和葉芽的休眠解除。

3 討論

在植物中,MAPK級聯途徑幾乎參與了植物全部的生長發育過程,在MAPK 信號轉導過程中發揮著樞紐作用。研究表明,桃MAPKs與休眠進程有關。處于休眠狀態的芽能夠萌發是因為生長促進物質(如GA)克服了生長抑制物質的抑制作用,從而解除了休眠[1]。由此推測,桃MAPKs可能通過響應激素信號來影響休眠。在桃[3,27]、櫻桃[1]、香椿[28]、平貝母[29]、蕓薹屬[30]、云南重樓[31]等植物中,植物休眠解除進程與植物體內GA含量的變化密切相關,在休眠解除期GA含量急劇升高,休眠解除后,GA含量又恢復到正常水平。本研究結果表明,GA 處理的中油四號離體枝條的芽發育飽滿,發育成熟度高,體積也顯著增加;且GA 處理后,MPK3表達上調,其中GA 處理后的枝條中MPK3 在5～7 d時,表達量急劇增高,7 d時達到最高峰,最終相對表達量是處理前的30倍。MPK3 相對表達量伴隨GA 處理急劇增高,說明MPK3 能夠響應GA 正調控,與前人研究一致。

本研究還發現中油四號在2017年10月15 至12月1日處于深休眠期;2017年12月15日芽體已經進入休眠解除期;2018年1月15日左右休眠解除;深休眠期間GA 在芽中含量穩定,在休眠解除過程中,GA含量迅速上升?；ㄑ亢腿~芽中的MPK3 在休眠解除期的表達均呈先升高后降低的趨勢,葉芽中MPK3的表達與花芽中的變化過程相似,但時間點具有滯后性,迅速增長期和最高峰較花芽晚13 d,出現在2018年1月27日?；ㄑ亢腿~芽中MPK3的表達與休眠解除期的進程保持一致,同時也符合桃樹先開花后長葉的生長特點。

4 結論

圖8 桃PpMPK3與不同物種中的MAPK 成員的蛋白質序列對比Fig.8 The protein sequences of peach PpMPK3 compared with MAPK members in different species

圖9 桃PpMPK3與其他物種PpMPK3 蛋白的系統進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of PpMPK3 proteins in peach and other species

圖10 PpMPK3 蛋白在煙草下表皮細胞中的定位Fig.10 Subcellular localization of PpMPK3 protein in nico-tianabenthamiana lower epidermal cell

圖11 PpMPK3基因在葉芽(A)和花芽(B)中的表達分析Fig.11 Expression analysis of PpMPK3 gene in leaf bud (A) and flower bud (B)

本研究從中油四號材料中提取到cDNA,克隆得到了桃MPK3基因,通過生物信息學分析和熒光定量表達分析證明,桃芽能響應GA 信號,提高休眠解除期芽內MPK3的表達量,進而促進休眠解除,進一步驗證了前人觀點。本研究結果為PpMPK3 蛋白結構分析和功能鑒定提供了一定的理論依據。今后可從MPK3如何響應GA 信號以及種子內MPK3的表達模式等方面開展更深入的研究。