外源水楊酸對煙草幼苗低溫脅迫的緩解效應

侯爽，陳錦芬，劉溶榮，王瑞，陳俊鴻，鄒聰明，謝小玉*

外源水楊酸對煙草幼苗低溫脅迫的緩解效應

侯爽1，陳錦芬1，劉溶榮1，王瑞1，陳俊鴻2，鄒聰明3*，謝小玉1*

(1.西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715；2.云南省煙草公司紅河州公司，云南 彌勒 661500；3.云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 657000)

為探究外源水楊酸(SA)對烤煙在低溫脅迫下的緩解作用，運用人工氣候培養箱模擬4 ℃低溫，設置SA(質量濃度10、25、50、100、150 mg/L)對盆栽K326煙草幼苗進行連續3 d根灌預處理，隨后再進行連續4 d的低溫處理，以常溫(25 ℃)作為正向對照(CK)，以4 ℃低溫且未施用外源SA處理為負向對照(CK0)，測定煙草葉片的相對電導率、丙二醛(MDA)含量、滲透調節物質含量、抗氧化酶活性、非酶抗氧化劑含量等指標。結果表明：4 ℃脅迫前根施3 d SA預處理下的煙草幼苗，在隨后持續4 d的低溫脅迫后，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性均顯著提高，這3種保護酶分別在50、10、25 mg/ L SA處理下活性最高；谷胱甘肽還原酶(GR)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性增強，其中GR和APX活性分別在根施100 mg/ L和50 mg/ L SA處理下達到最大值；低溫脅迫下煙草幼苗可溶性糖(SS)含量在10 mg/L SA處理下較CK0提高了17.46%，可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(Pro)、抗壞血酸(ASA)在50 mg/L SA處理下含量均達到最高，較CK0分別提升了30.35%、316.44%和31.21%，還原型谷胱甘肽(GSH)含量在25 mg/L SA處理下較CK0顯著提高了51.38%，這些指標的提升，緩解了REC和MDA含量在低溫脅迫下的上升?？购噪`屬函數分析表明，50 mg/L的SA預處理對4 ℃低溫脅迫下的K326具有最大緩解效應。

煙草；外源水楊酸；低溫脅迫；緩解作用

煙草是喜溫植物，對低溫較為敏感，缺乏冷適應機制，25~28 ℃是煙草生長的最適溫度。中國大部分煙區自然氣候適宜種植煙草，但仍然存在氣溫較低或者氣溫波動較大的極端氣候[1]，福建、江西等南方煙區，煙苗移栽后倒春寒帶來的低溫冷害問題普遍存在[2]。低溫冷害是影響煙草種植最嚴重的非生物脅迫因素。從表觀形態上看，低溫脅迫引起發芽率降低、幼苗發育不良、葉片黃化、阻礙葉片伸展，同時導致葉片萎蔫，抑制葉片的光合速率，嚴重時甚至可能導致組織死亡[3–4]；從內部代謝角度看，低溫脅迫下活性氧(ROS)大量產生，最終導致細胞膜的相變或氧化損傷[5]；極端低溫還會破壞細胞內環境的平衡，破壞植物正常的新陳代謝[6]。近年來，外源水楊酸(SA)被大量應用于緩解植物低溫脅迫[7–9]。筆者以低溫敏感型煙草品種K326為材料，以常溫(25 ℃)生長作為正向對照(CK)，以未施用外源SA預處理且持續4 d 4 ℃處理的煙草幼苗為負向對照(CK0)，設置5個外源SA質量濃度(10、25、50、100、150 mg/L)，對低溫處理前的煙草幼苗進行連續3 d的根灌預處理，隨后進行持續4 d低溫處理(4 ℃)，測定煙草葉片相對電導率、丙二醛(MDA)含量、滲透調節物質含量、抗氧化酶活性和非酶抗氧化劑含量等指標，探討外源SA提高煙草抗低溫脅迫能力的機理，以期為緩解煙草低溫脅迫提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料

烤煙品種K326，由中煙種子有限責任公司提供。

1.2　試驗設計

試驗于2019年3月至7月在西南大學試驗農場溫室和人工氣候培養箱中進行?？緹熎∮?，常規管理。待幼苗長到4片真葉時，挑選長勢好、大小一致的幼苗移栽于裝有育苗基質的塑料盆中(盆高17 cm、直徑15 cm)，置于人工氣候培養箱培養(白天25 ℃、光照度20 000 lx、14 h，夜間18 ℃、10 h)，每隔3 d于9:00根施1/2 Hoagland營養液50 mL。待幼苗長出第9片葉時，分為7組(每組3盆，每盆留1苗)，取其中2組分別作為正向對照(CK)和負向對照(CK0)：CK于人工氣候培養箱25 ℃培養，CK0于人工氣候培養箱25 ℃培養3 d后，進行4 ℃處理。另外5組于人工氣候培養箱25 ℃培養3 d，每天9：00分別根施50 mL質量濃度分別為10、25、50、100、150 mg/L外源SA溶液，3 d后進行4 ℃處理，連續4 d后，于第8天9：00—10：00 對7組煙苗葉片取樣(液氮速凍，–80 ℃保存)，測定各項生理指標。每個處理3次重復。

1.3　測定項目及方法

采用上海優選生物科技有限公司生產的丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、脯氨酸(Pro)含量檢測試劑盒、植物可溶性糖試劑盒、可溶性蛋白含量測定試劑盒、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定試劑盒、抗壞血酸(ASA)含量檢測試劑盒和還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒分別測定煙葉丙二醛、脯氨酸、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)含量、APX活性、GR活性、ASA和GSH含量。相對電導率采用陳愛葵等[10]的方法測定。

使用上海凈信JXFSTPRP–48型打樣機低溫快速研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液即粗酶液進行保護性酶活性測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定[11]；過氧化氫酶(CAT)活性采用上海優選生物科技有限公司生產的過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(比色法)測定。

1.4　統計方法

采用Microsoft Excel 2006和 SPSS 18.0 軟件中的Duncans多重比較分析法，對試驗數據進行統計分析。采用隸屬函數值法對抗寒性進行分析：當生理指標增加有利于提高植株抗低溫能力時，選擇隸屬函數公式U=(U–min)/(max–min)；反之，則選擇隸屬函數公式U=1–(U–min)/(max–min)。式中：max為某系列指標測定最大值；min為某系列指標測定最小值；為相應系列指標測定值。最后計算出各指標的隸屬函數值的加權平均數。

2　結果與分析

2.1　外源水楊酸對低溫脅迫煙草MDA含量和相對電導率的影響

煙草葉片質膜透性和MDA含量測定結果列于表1。根施10~150 mg/L的外源SA時，隨著SA濃度的增加，葉片相對電導率先下降后上升，各處理較CK0分別下降了24.74%、49.73%、40.99%、33.92%、30.11%；25 mg/L外源SA處理下，相對電導率降至最低，與CK無顯著差異。在10~150 mg/L外源SA處理下，隨著SA質量濃度的增加，葉片MDA含量上升，10~100 mg/L的外源SA處理具有緩解效應，各處理較CK0分別下降了34.62%、34.49%、31.36%、12.87%，10~50 mg/L外源水楊酸處理具有最佳緩解效果。

表1　外源水楊酸處理低溫脅迫煙葉的相對電導率和MDA含量

不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。

2.2　外源水楊酸對低溫脅迫煙草葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1對SOD、POD、CAT活性的影響

表2結果表明，CK0處理后，煙葉保護性酶SOD、POD、CAT活性較CK分別下降了10.54%、30.15%、20.58%，與各自CK均存在顯著差異(<0.05)。低溫脅迫下，外源SA質量濃度10~150 mg/L處理，SOD活性均顯著高于CK0的(<0.05)，分別上升了12.85%、19.00%、30.11%、16.20%、17.13%，整體呈先上升后下降的趨勢，在外源SA質量濃度為50 mg/L時，SOD活性達到最大值；隨著外源SA質量濃度的增加，POD活性呈先上升后下降的趨勢，較CK0處理分別上升了40.38%、56.05%、44.49%、43.37%、27.10%，與CK0均存在顯著差異(<0.05)，在25 mg/L時達到最大值；4 ℃脅迫下，在10 mg/L外源SA處理下，CAT活性達到最大值，隨著外源SA質量濃度的增加，CAT活性呈下降的趨勢，10~150 mg/L各處理較CK0處理CAT活性分別上升了104.53%、79.17%、69.36%、37.56%、31.92%。

2.2.2對APX和GR活性的影響

表2結果表明，根施10~150 mg/L外源SA，均顯著提高了4 ℃低溫下煙草幼苗葉片APX酶的活性，10~50 mg/L時，隨著外源SA質量濃度的增加，APX酶活性上升；SA超過50 mg/L，隨著SA質量濃度增加，APX活性下降；CK0處理下GR活性大幅度下降，CK下降了66.64%，且存在顯著差異(<0.05)。低溫脅迫下，隨著外源SA質量濃度的增加，GR活性呈先上升后下降的趨勢，25~150 mg/L外源SA處理下，GR活性均顯著高于CK0處理，分別提升了33.19%、62.21%、195.11%、105.51%，100 mg/L外源SA處理的GR活性達到最大值，緩解效應最佳。

表2　外源水楊酸處理煙草幼苗葉片抗氧化酶的活性

不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。

2.3　外源水楊酸對低溫脅迫下煙草葉片滲透調節物質的影響

如表3所示，CK0處理下，煙草幼苗滲透調節物質含量較CK均呈顯著上升的趨勢，低溫脅迫下煙草幼苗具有一定的抵抗力，隨著根施水楊酸濃度的增加，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈先上升后下降的趨勢?？扇苄蕴呛吭诟㏒A 10 mg/L時達到最大值，較CK0提高了17.46%，且存在顯著差異(<0.05)；根施10~150 mg/L外源SA，可溶性蛋白含量較CK0分別上升了8.60%、8.78%、30.35%、4.67%、3.14%，在50 mg/L處理下，可溶性蛋白含量達到最大值，且與CK0處理存在顯著差異(<0.05)；脯氨酸含量在外源SA各濃度處理下均顯著高于CK0處理(<0.05)，10~150 mg/L外源SA處理下，脯氨酸含量較CK0分別上升了250.73%、272.88%、316.44%、187.98%、115.35%，50 mg/L SA處理下脯氨酸含量達到最大值。

表3　外源水楊酸處理低溫脅迫煙苗葉片滲透調節物質的含量

2.4　外源水楊酸對低溫脅迫下煙草幼苗葉片非酶抗氧化劑含量的影響

CK0處理時，ASA和GSH含量較CK顯著降低，分別下降了4.25%、20.63%。隨著外源SA的施用，在適宜濃度下ASA和GSH含量均得到有效提升。10~100 mg/L外源SA處理, 煙葉ASA含量均顯著高于CK0的(<0.05)，較CK0的ASA含量分別上升了13.60%、21.90%、31.21%、4.72%，在50 mg/L外源SA處理下，ASA含量達到最高值；10~150 mg/L外源SA處理，各組GSH含量均顯著高于CK0的(<0.05)，分別提升了45.21%、51.38%、42.98%、25.44%、17.04%，隨著外源SA質量濃度的增加，GSH含量呈先上升后下降的趨勢，在25 mg/L外源SA處理時，GSH含量達到最大值，具有最大緩解效應(表4)。

表4　外源水楊酸處理煙草幼苗ASA和GSH含量

2.5　隸屬函數綜合分析

計算煙葉各項指標的隸屬函數值(表5)，得到4 ℃脅迫下，0~150 mg/L外源SA處理的各組對低溫脅迫的緩解效應，由大到小依次為50 mg/L、25 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、CK0處理，50 mg/L的外源SA處理綜合值最高，說明該處理對4 ℃脅迫的K326具有最大緩解效應。

表5　外源SA處理低溫脅迫煙苗抗寒指標隸屬函數值及綜合評價

3　結論與討論

本研究中，保護性酶(SOD、POD、CAT)在低溫脅迫持續4 d且未施用外源SA(CK0)條件下，它們的活性較CK均顯著下降，表明K326煙草幼苗的保護酶系統在4 ℃下并不能有效發揮功能，無法通過提高保護性酶活性來降低細胞膜的氧化與過氧化損傷。在設置的5個外源SA濃度下，3種酶活性均有提高，SOD、CAT、POD在各自最適濃度的外源SA作用下，活性最大，能較CK0分別提高30.11%、104.53%、56.05%，這說明適宜濃度的外源SA對提高低溫脅迫下的煙草幼苗保護性酶活性有著顯著的效果[12]，增強植株在低溫逆境下清除活性氧自由基的能力，防止膜系統的氧化損傷和過氧化損傷，增強幼苗的抗寒能力，有助于煙草幼苗順利度過低溫逆境，這與刁倩楠等[13]、周麗霞等[14]、陳明輝等[15]的研究結果一致。

APX和GR活性在連續4 d的4 ℃脅迫下均顯著下降，與保護性酶的變化趨勢一致，此時AsA–GSH 循環受阻礙，會導致清除H2O2等活性氧自由基的效率降低，葉綠體內過量的H2O2無法被有效清除，將引起內膜系統受損，光合效率降低，嚴重時甚至無法進行光合作用。經過外源SA預處理的煙草幼苗在4 ℃脅迫下，APX和GR均能維持在較高水平，有利于保障AsA–GSH 循環的正常運轉，維持葉綠體等SOD、POD、CAT功能發揮不足的細胞器的正常結構，進而正常發揮功能。

煙草幼苗在4 ℃脅迫處理下，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較CK均顯著上升，說明植株對于低溫具有一定的抵抗力，但根施外源SA后，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量進一步上升，其中脯氨酸含量增加幅度尤為顯著。細胞質中脯氨酸含量的增加，不僅能夠調節細胞的滲透勢，而且能夠很好地保護細胞質中的各種酶；可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加，可以維持細胞較低的滲透勢，并且可溶性蛋白親水力較強，可以保證植物在低溫逆境下的持水能力[16–17]。

非酶抗氧化劑是植物體內產生的能有效阻止或延緩自動氧化的物質，一方面作為非酶抗氧化劑能在植物遭受逆境脅迫，ROS的產生與降解平衡被打破的情況下，減緩ROS的產生速率或者直接清除過量的ROS；另一方面能提高內源性抗氧化物質的水平或抑制氧化酶的表達，亦或同時執行上述兩個功能[18]。ASA和GSH是重要的非酶抗氧化劑。許英等[19]研究發現，ASA 可在逆境脅迫下還原O2–，能有效清除OH–、H2O2等 ROS，GSH因其結構中具有活性的巰基，容易被氧化，因此，在逆境脅迫下，能夠減緩膜系統中不飽和脂肪酸及其他部位的氧化分解，防止細胞膜過氧化，從而保持細胞膜系統的穩定，增強植物逆境下的抗性。4 ℃低溫脅迫持續4 d后，CK0處理下ASA和GSH含量較常溫CK均顯著下降，低溫逆境下非酶抗氧化劑ASA和GSH含量的降低，致使植株的低溫抗性從非酶抗氧化劑處得到的支持減弱，植株對ROS的降解能力相對降低，對氧化酶的表達抑制能力下降，導致植株在低溫脅迫下抗氧化能力減弱，抗寒性降低。根施適宜濃度的外源SA能有效提高ASA和GSH的含量，進而增強低溫脅迫下煙草植株的抗氧化能力，提升植株對ROS的降解效率以及抑制氧化酶的表達，這與黃志明等[20]在枇杷中的研究結果一致。

本研究中，CK0的煙葉相對電導率和MDA含量較CK均大幅增加，此時，胞內電解質大量外滲，膜系統破損嚴重，嚴重時將導致光合磷酸化和氧化磷酸化解偶連，ATP的生成過程受到破壞，代謝紊亂，植株無法正常生長，致使植株死亡[19–20]。由于低溫脅迫前，對煙草幼苗進行適宜濃度的外源SA預處理，滲透調節物質可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著增加，在維持細胞滲透勢的同時，降低冰點，增強細胞的持水能力，其中外源SA作用下產生的大量脯氨酸亦能延緩抗氧化酶的降解，保護性酶活性、非酶抗氧化劑含量和抗氧化酶活性也得到了提升，從而有效降低了低溫逆境下煙草幼苗的損傷程度，增強了植株的低溫抗性，MDA含量和相對電導率的上升趨勢得到有效抑制。

隸屬函數法能根據所測定的多個指標，對植物的抗寒能力進行綜合全面的評價。對各指標進行隸屬函數綜合分析的結果表明, 50 mg/L的外源SA處理對4 ℃脅迫下的K326具有最佳緩解效應，能有效抵御低溫脅迫對煙株的傷害，有利于煙株順利度過低溫逆境，減少損失。

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Mitigative effect of exogenous salicylic acid on low temperature stress in tobacco seedlings

HOU Shuang1, CHEN Jinfen1, LIU Rongrong1, WANG Rui1, CHEN Junhong2, ZOU Congming3*, XIE Xiaoyu1*

(1.College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2.Honghe Branch of Yunnan Tobacco Company, Mile, Yunnan 661500, China; 3.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan 657000,China)

In order to investigate the mitigating effect of exogenous salicylic acid (SA) on flue-cured tobacco under low temperature stress, our experiment used an artificial climate incubator to simulate a low temperature of 4 ℃, and set five mass concentrations of exogenous salicylic acid (SA) (10, 25, 50, 100, 150 mg/L) to pretreat potted K326 tobacco seedlings through roots for 3 consecutive days, followed by low temperature stress treatment for 4 consecutive days. Normal temperature (25 ℃) growth was used as a positive control (CK), and a low temperature of 4 ℃without the application of exogenous SA was performed as a negative control (CK0). The relative electrical conductivity, malondialdehyde (MDA) content, osmotic adjustment substance content, antioxidant enzyme activity and non-enzyme antioxidant content of tobacco leaves were measured. The results showed that the application of exogenous SA could significantly increase the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD). The enzymes were the most active under 50, 10, 25 mg/L exogenous SA treatment, respectively; the glutathione reductase (GR) and ascorbate peroxidase (APX) activities were increased, and GR and APX activities reached the maximum under the treatment of 100 mg/L and 50 mg/L exogenous SA respectively. Under low temperature stress, the soluble sugar (SS) content of tobacco seedlings was increased by 17.46% compared to CK0under the treatment of 10 mg/L exogenous SA. The contents of soluble protein (SP), proline (Pro), and ascorbic acid (ASA) were the highest at 50 mg/L exogenous, which increased by 30.35%, 316.44% and 31.21% respectively compared with CK0. The content of reduced glutathione (GSH) was significantly increased by 51.38% compared with CK0under 25 mg/L exogenous SA treatment. The improvement of various indicators has alleviated the rise of REC and MDA content under low temperature stress, and cold resistance membership function analysis shows 50mg /L exogenous SA treatment had the greatest alleviation effect on K326 under 4 ℃ low temperature stress.

tobacco; exogenous salicylic acid; low temperature stress; mitigation

10.13,331/j.cnki.jhau.2020.01.003

S572.01

A

1007-1032(2020)01-0014-07

2019–10–18

2019–12–20

云南省煙草專賣局科技計劃重點項目(2017yn09)

侯爽(1993—)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事植物生理與分子生物學研究，hs152012@163.com；

，謝小玉，博士，副教授，主要從事植物生理與分子生物學研究，xiexy8009@163.com；*通信作者，鄒聰明，副研究員，主要從事煙葉栽培與調制研究，284630460@qq.com

侯爽，陳錦芬，劉溶榮，王瑞，陳俊鴻，鄒聰明，謝小玉．外源水楊酸對煙草幼苗低溫脅迫的緩解效應[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2020，46(1)：14–20．

HOU S, CHEN J F, LIU R R, WANG R, CHENG J H, ZOU C M, XIE X Y. Mitigative effect of exogenous salicylic acid on low temperature stress in tobacco seedlings[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1):14–20.

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維