銀耳多糖醇沉級分對酪氨酸酶的抑制作用

楊芳，王藝涵，袁辛銳，遲原龍，姚開，賈冬英*

1. 四川大學輕工科學與工程學院（成都 610065）；2. 四川白家食品產業有限公司（成都 610065）

酪氨酸酶是含銅的氧化還原酶，廣泛分布于生物體中，具有雙重催化活性，既可催化L-酪氨酸羥基化生成L-多巴，也可將L-多巴氧化生成多巴醌，后者進一步氧化聚合形成黑色素[1]，是參與人體皮膚黑色素形成的關鍵酶。抑制酪氨酸酶活性可減少體內黑色素和色斑的生成，從而起到美白祛斑的作用[2-3]。從天然食材中提取分離得到安全、高效的酪氨酸酶抑制劑已成為目前研究熱點[4]。研究表明，某些植物多糖對酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。Yang等[5]發現，龍眼果皮多糖具有良好的酪氨酸酶抑制活性，能夠抑制L-酪氨酸生成L-多巴；Tang等[6]研究顯示，板栗多糖可抑制酪氨酸酶活性，該抑制作用屬于競爭性抑制。

銀耳俗稱白木耳、雪耳，自古以來就是女性美容養顏佳品。多糖是銀耳的主要活性物質，具有增強免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、修復記憶障礙等生物活性[7-9]。來吉祥等[10]發現，銀耳多糖具有優良的保濕功效，用于化妝品中可減輕皮膚粗糙度，增強皮膚彈性。劉卉[11]研究顯示，化妝品中以0.05%銀耳多糖替代0.02%透明質酸能達到更好的保濕效果。然而，關于銀耳多糖對酪氨酸酶的抑制作用卻鮮有報道?；诖?，試驗比較不同銀耳多糖醇沉級分對酪氨酸酶的抑制作用，探討其對酪氨酸酶的抑制作用類型，以期為銀耳多糖在化妝品中的高附加值利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福建古田銀耳（市售）。

酪氨酸酶（730 U/mg）、L-酪氨酸、L-多巴（上海源葉生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、葡聚糖系列標準品（2.5～5 348 kDa，色譜純試劑）（美國Sigma公司）。

1.2 儀器與設備

SNB-2數字黏度計（上海精天儀器有限公司）；UV6000PC-1100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Spectra Max 190全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）；Waters Breeze GPC凝膠滲透色譜儀（美國沃特斯有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 銀耳多糖分步醇沉級分的制備與純化

1.3.1.1 銀耳多糖分步醇沉級分的制備

參考高溫高壓法[12]提取銀耳多糖，并稍作修改。稱取一定質量的干銀耳，加入其60倍質量的飲用純凈水，浸泡20 min后打漿，將所得漿液于0.1 MPa、121℃下加壓提取30 min，離心后得到上清液，于60 ℃下真空濃縮使其黏度達到3.4±0.1 Pa/s（25 ℃，轉子#4，60 r/min），得到濃縮液。

在濃縮液中加入無水乙醇使體系乙醇體積分數達20%，攪拌后于4 ℃下靜置24 h，離心后分別收集沉淀物與上清液；將所得沉淀物用無水乙醇及丙酮洗滌、抽濾后進行真空冷凍干燥，得到銀耳多糖醇沉級分STP 20。將所得的上清液真空濃縮至上述黏度，加入無水乙醇調整體系乙醇體積分數40%，攪拌后按照上述方法進行靜置沉淀和離心、洗滌、抽濾、干燥得到STP 40。將所得上清液按照上述方法依次調整體系的乙醇體積分數分別達到60%，80%得到銀耳多糖級分STP 60、STP 80。將得到的4種銀耳多糖級分稱質量后按照式（1）計算其得率。

式中：m為干燥多糖級分質量，g；M為干銀耳質量，g。

1.3.1.2 銀耳多糖醇沉級分STP 60的純化

采用DEAE-Cellulose 52柱層析，濕法裝柱（Φ2×30 cm）。配制10 mg/mL的STP 60水溶液，以0.4 mL/min流速上樣10 mL后先用多于1倍柱體積的去離子水洗脫，依次用0.2，0.4和0.6 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每10 min收集1管；隔管取0.5 mL，用苯酚-硫酸法檢測其多糖含量，繪制洗脫曲線；收集同一洗脫峰溶液，經透析、濃縮、凍干后得到純化STP 60。

1.3.2 銀耳多糖醇沉級分純度測定

以葡萄糖溶液為標準品，苯酚-硫酸法[13]測定其在不同質量濃度下反應液的吸光度，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸后得到回歸方程y=0.008 1x-0.010 6（R2=0.999 1）。按照同樣方法測定4種銀耳多糖醇沉級分溶液的吸光度，將其代入回歸方程后計算出多糖樣品的純度。

1.3.3 銀耳多糖醇沉級分的相對分子質量與純化STP 60的單糖組成分析

1.3.3.1 醇沉級分的相對分子質量測定

參照Mao等[14]所述凝膠滲透色譜法測定銀耳多糖級分的相對分子質量。GPC色譜條件：色譜柱為Ultrahyrogel linear（7.8 mm×300 mm），檢測器為2400示差折光檢測器，柱溫40 ℃，流動相為0.2 mol/L NaNO3溶液，pH 6.0，流速0.6 mL/min，對照品為窄分布的葡聚糖。

1.3.3.2 純化STP 60的單糖組成分析

參考Dai等[15]所述的3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生HPLC法，測定純化STP 60的單糖組成。以鼠李糖、巖藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為對照品。

HPLC條件：色譜柱為SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫25 ℃、流動相為0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）和乙腈混合液（82︰18，V/V）、流速1.0 mL/min、檢測波長245 nm。

1.3.4 銀耳多糖對酪氨酸酶的抑制作用

1.3.4.1 對酪氨酸酶單酚酶的抑制作用

參考Maisuthisakul等[16]方法，并稍作修改。將90 μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.8）和50 μL 100 μg/mL酪氨酸酶溶液依次加入到50 μL 1 mg/mL銀耳多糖醇沉級分溶液中，混合均勻后于37 ℃下預熱5 min，加入60 μL 2.5 mmol/L的L-酪氨酸溶液，混勻后于該溫度下保持10 min，振蕩后立即于490 nm處測定反應液的吸光度。以維生素C作為陽性對照，每一樣品重復測定3次。按照以式（2）計算樣品對酪氨酸酶單酚酶的抑制作用。

式中：A1、A2、A3、A4分別是樣品組、樣品背景組（PBS代替酪氨酸酶）、空白組（蒸餾水代替樣品）、空白背景組（蒸餾水代替樣品、PBS代替酪氨酸酶）的吸光度。

1.3.4.2 對酪氨酸酶雙酚酶的抑制作用

參照上述單酚酶抑制作用步驟，以2.5 mmol/L L-多巴溶液替代2.5 mmol/L L-酪氨酸溶液，于37 ℃下繼續保持2 min，振蕩后立即于490 nm處測定吸光度。按照式（2）計算樣品對酪氨酸酶雙酚酶抑制率。

1.3.5 銀耳多糖STP 60對酪氨酸酶單酚酶的抑制作用類型與動力學分析

1.3.5.1 抑制作用類型分析

固定底物L-酪氨酸溶液濃度2.5 mmol/L，改變酪氨酸酶濃度，測定4種質量濃度STP 60時的酶活力，以酪氨酸酶濃度為橫坐標、酪氨酸酶活力為縱坐標作圖，根據二者的關系判斷STP 60對該酶的抑制作用[17]。

1.3.5.2 抑制作用動力學分析

固定酪氨酸酶質量濃度為100 μ g/mL，改變底物L-酪氨酸濃度，測定4種質量濃度STP 60時的酶活力，根據Lineweaver-Burk法繪制底物濃度與酶反應速率的雙倒數圖，分析STP 60對酪氨酸單酚酶的動力學[18]。

1.3.6 數據分析

除分子量外，其余試驗結果均以均數±標準差表示，采用OriginPro 2017繪圖，采用SPSS 21.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖醇沉級分的得率和純度及相對分子質量與單糖組成

4種銀耳多糖醇沉級分的得率、純度及分子量見表1。4種銀耳多糖級分的得率和純度差異顯著，以STP 60為最高，表明銀耳多糖主要是由STP 60為代表的中分子量多糖構成。隨著醇沉時乙醇體積濃度增大，銀耳多糖級分的重均分子量和數均分子量逐漸減小，但均在同一數量級；4種級分的多分散系數遠大于1，表明其分子量分布范圍較廣，以STP 60最為明顯。

表1 銀耳多糖分步醇沉級分的得率和純度與相對分子質量

純化STP 60經PMP柱前衍生后的HPLC檢測圖譜如圖1所示。STP 60是由甘露糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖和半乳糖醛酸組成，其摩爾比為871.72︰323.94︰251︰218.03︰15.51︰3.95︰2.01︰1.66︰1.03︰0.74。銀耳多糖的單糖組成以甘露糖、巖藻糖、木糖和葡萄糖醛酸為主，甘露糖含量最高，因此STP 60可能是以甘露聚糖為主鏈的酸性雜多糖。試驗結果與Ukai等[19]得到的銀耳子實體多糖的單糖組成相似，但其含量差異較大，尤其是巖藻糖的含量明顯偏高，這可能與銀耳的產地、栽培方式及多糖的提取方法有關。

圖1 純化STP 60的HPLC色譜圖

2.2 銀耳多糖對酪氨酸酶的抑制作用

4種銀耳多糖級分對酪氨酸酶單酚酶和雙酚酶的抑制作用如圖2所示。它們對酪氨酸酶均有一定抑制作用，其對單酚酶活性的抑制作用明顯強于雙酚酶，其中STP 60的抑制作用最大，STP 20的抑制作用最小。4種級分的抑制作用與其純度呈正相關，純度越高，其抑制作用越大。純度最高的STP 60在質量濃度為1 mg/mL的條件下，對單酚酶和雙酚酶的抑制率分別為37.55%和9.94%，其抑制作用明顯高于羊棲菜多糖[20]和板栗多糖[6]。然而，銀耳多糖級分對酪氨酸酶的抑制作用明顯低于維生素C，這主要是因為后者既是一種強抗氧化劑，也是一種金屬離子螯合劑，它可以通過強大的抗氧化和螯合銅離子2種途徑產生明顯的抑酶作用。

圖2 銀耳多糖級分對酪氨酸酶的抑制作用

2.3 STP 60對酪氨酸單酚酶的抑制作用類型與抑制動力學

抑制劑對酶活性的抑制作用分為可逆抑制和不可逆抑制。利用酶活性與酶的關系圖區分可逆抑制劑和不可逆抑制，直線過原點為可逆抑制，直線平行則為不可逆抑制。在酶活測定體系中，加入不同質量濃度的STP 60，以酪氨酸酶濃度為橫坐標、酶活力為縱坐標作圖，得到二者之間的關系，如圖3所示?？梢钥闯?，4條直線均通過原點，且隨著STP 60濃度增大，直線斜率變小，說明STP 60對酪氨酸酶的抑制作用具有可逆性，與酶之間以非共價鍵發生可逆結合[16]，不會使酪氨酸酶永久失活。

圖3 酪氨酸酶單酚酶活性與酶濃度的關系

圖4 為4種質量濃度的STP 60對酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數圖。4條直線均相交于第二象限X軸上一點，隨著STP 60濃度增大，直線與縱坐標截距增大，也就是說，隨著STP 60濃度增加，米氏常數Km保持不變，最大反應初速度Vmax逐漸減小。參數變化表明，STP 60對酪氨酸酶的抑制作用為非競爭性抑制，即底物、抑制劑和酶之間的結合無競爭性。因此，STP 60對酪氨酸酶的抑制作用為非競爭性可逆抑制，這一結果與Yang等[5]關于龍眼皮多糖的研究結果一致。對酪氨酸酶而言，其非競爭性抑制劑通常是由于結合酶活性中心以外的殘基而影響了酶活性，也可能是由于抑制劑對氧自由基的清除作用阻礙酶催化反應[4]。

圖4 STP 60對酪氨酸酶單酚酶活性的Lineweaver-Burk雙倒數圖

3 結論

4種銀耳多糖醇沉級分對酪氨酸酶的單酚酶活性和雙酚酶活性均具有一定抑制作用，且對單酚酶活性的抑制作用明顯強于雙酚酶活性抑制，其中STP 60對單酚酶活性的抑制作用最大，屬于非競爭性可逆抑制。有關銀耳多糖對此酶的抑制作用機理有待深入探討。