山藥多糖提取工藝的響應面法優化及其功能活性分析

段偉萍，李新蕊，司明東，李可昕，溫子帥，馬東來，*

（1.河北中醫學院藥學院，河北石家莊050200；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023）

山藥為薯蕷科植物薯蕷（Dioscoreaopposita Thunb.）的塊莖，為多年生纏繞草木植物，屬藥食兼用材料[1-2]。山藥富含蛋白質、粗纖維、淀粉、多糖、尿囊素、皂苷等多種化學成分，現代藥理研究結果表明其具有降血糖、抗氧化、抗衰老、調節免疫等作用[3-5]。山藥中的有效成分之一是多糖，研究表明，山藥多糖具有較強的自由基清除作用、抗氧化作用，這與其組分、結構密切相關[6]，如朱嬌嬌等[7]報道了山藥多糖提取物能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，可達到60%。山藥多糖常用提取方法有回流提取法、超聲提取法和微波提取法等，如李培[8]報道了酶法提取山藥多糖，并探討了山藥多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用條件：山藥多糖濃度40 mg/mL，溫度 40℃，時間 10 min，pH 7.2 時，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶具有較強抑制作用，抑制常數Ki為65.78 mg/mL。

本試驗以山藥為原料，利用Box-Behnken設計-響應面法優化山藥多糖的超聲輔助提取工藝，再經過醇沉、Sevag法脫蛋白和透析等步驟，得到山藥多糖?？疾觳煌a地山藥多糖對α-葡萄糖苷酶酶活的抑制和體外抗氧化活性，以期為山藥的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

1.1.1 材料

祁山藥、廣西山藥、河南懷山藥、安國懷山藥樣品：河北安國東方中藥材市場，經河北中醫學院鄭玉光教授鑒定均為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的塊莖。

1.1.2 試劑

羥自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒：南京建成生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖：美國Sigma公司；甲醇、乙酸等試劑均為分析純：天津市永大化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器設備

島津UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；ME204E型十萬分之一電子天平：德國SARTORIUS公司；KQ-300DE型數控超聲波提取器：昆山市超聲儀器有限公司；索氏提取器：北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山藥純多糖的制備

參照文獻方法[9-10]，精密稱取山藥細粉5.0 g，采用索氏提取器脫脂處理后，脫脂后固體置100 mL錐形瓶中，按不同料液比加入純水，在不同溫度和不同時間下超聲輔助提取山藥多糖，冷卻并過濾，濾液減壓濃縮至10 mL，加入95%乙醇40 mL，在4℃下靜置醇沉48 h，過濾，真空冷凍干燥后，得山藥粗多糖。

將上述山藥粗多糖溶解在5 mL純水中，利用Sevag法脫蛋白，加入氯仿∶正丁醇（體積比為4∶1）混合溶液，進行多次脫蛋白處理，直至無蛋白層。脫蛋白后多糖水液體裝入透析袋（截留分子量3 500 Da），在72 h內用純水不斷更換透析。將透析后的山藥多糖水溶液放入真空冷凍干操器內干燥，得到山藥多糖M mg，并計算山藥多糖的提取率：

1.2.2 多糖含量的測

采用苯酚-硫酸法[6]。以葡萄糖對照品為基準，繪制以濃度X（mg/mL）為橫坐標和吸光度Y為縱坐標的標準曲線：Y=64.931X-0.001 8，R2=0.999 1。

1.2.3 Box-Behnken設計-響應面法優化工藝條件

在單因素試驗的基礎上，以超聲提取溫度（X1）、超聲提取時間（X2）和液料比（X3）為自變量，山藥多糖提取率為因變量，并利用Box-Behnken設計試驗組，共17 組[11-12]，見表 1。

1.2.4 山藥多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用

參照Anastasia方法[13]，在10 mL容量瓶中加入0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶0.4 mL，不同濃度山藥多糖溶液0.2 mL或0.5 mg/mL阿卡波糖溶液0.1 mL，搖勻，置37℃水浴中保溫20 min。分別加入2 mmol/L PNPG溶液0.1 mL后，搖勻，置37℃水浴中保溫15 min，取出冷卻后，分別加入0.5 mol/L Na2CO3溶液1 mL，用純水定容。分別于405 nm波長下測定吸光度A1。用等量的純水替代山藥多糖溶液作為空白組。計算α-葡萄糖苷酶抑制率公式如下：

表1 因素水平表Table 1 Factor and evel

式中：A0、A1分別為空白組和試驗組的吸光度值。

1.2.5 山藥多糖的抗氧化性能

1.2.5.1 DPPH·清除能力

山藥多糖對DPPH·清除率的測定，參照葛明明等DPPH·清除率測定方法[14-15]。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液0.2 mL，用甲醇定容于1 mL容量瓶中，混合均勻，放置10 min，在517 nm處測定吸光度A。按下式計算DPPH·的清除率。

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用甲醇替代0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液的吸光度；A空白為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.2.5.2 OH·清除能力

山藥多糖對OH·清除率的測定，采用南京建成生物工程研究所提供的OH·自由基測定試劑盒。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，按試劑盒說明書操作，于550 nm處測定吸光度A。按下式計算OH·的清除活力：

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.2.5.3 O2-·清除能力

山藥多糖對O2-·清除率的測定，采用南京建成生物工程研究所提供的抑制超氧陰離子自由基測定試劑盒。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，按試劑盒說明書操作，于550 nm處測定吸光度A。按下式計算O2-·的清除率。

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.3 數據處理方法

試驗數據均按照對應的公式計算，平行測定3次（n=3），所得結果以平均值表示。數據處理及統計分別采用軟件origin 9.0和Design Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 山藥多糖響應面優化分析

2.1.1 試驗結果與模型建立

采用Box-Behnken設計試驗獲得的結果見表2，并應用Design Expert 8.0.6軟件對17個試驗結果進行多元回歸分析，得到以山藥多糖提取率為響應值的回歸方程：Y=9.34+0.64 ×X1+0.18×X2+0.064×X3+0.16×X1X2+0.31×X1X3+0.60×X2X3-0.62×X12-1.24×X22-0.87×X32。

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Response surface design and experimental results

2.1.2 方差分析與顯著性檢驗

方差分析表見表3。

由表3回歸方程方差分析結果可知，該模型P＜0.01表示差異具有顯著性，失擬項P＞0.05表示差異不顯著，說明該模型能較準確地預測提取溫度、提取時間和液料比對山藥多糖提取率的影響。同時，模型的相關系數R2為0.949 0和RAdj2為0.883 3，表明該模型對多糖提取過程能較好的進行分析和預測。變異系數C.V.值為4.61%，C.V.值越大表明該模型的置信度越高。由表3方差分析中各因素項的P值可知，一次項X1、二次項 X12、X22、X32和交互項 X2X3對山藥多糖提取率影響顯著，其余項影響不顯著，說明各因素與山藥提取率不是簡單的線性關系。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.1.3 響應面分析與最佳條件確定

圖1為以多糖提取率為響應值的4個因素的趨勢圖，圖中等高線可直觀地反應出兩變量間相互作用程度。

圖1C中響應面坡度較陡，表明料液比和提取時間兩個因素對山藥多糖提取率的影響較大。而圖1A和1B中，提取溫度一側的響應面坡度相對于料液比和提取時間要平緩，表明提取溫度對山藥多糖提取率的響應不靈敏。圖1響應面分析結果與回歸方差分析結果吻合。

圖1 響應曲面3D圖Fig.1 Response surface 3D plots for interaction

由Design Expert 8.0.6軟件分析計算，獲得山藥多糖的超聲輔助提取工藝的最佳條件，為了方便操作對所獲得的最佳工藝條件進行了修正：提取溫度為66℃，提取時間為 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），山藥多糖的預測提取率為9.55%。在在最佳條件下，重復平行驗證試驗5次，測得山藥多糖提取率為9.34%，與預測值偏差2.20%，表明所得模型能夠較好的預測山藥多糖的提取情況。

2.2 山藥多糖提取率與純度

利用山藥多糖最佳提取條件得到的不同產地的山藥多糖，按照“2.1”、“2.2”項下相關方法計算山藥多糖的提取率和純度見表4。

其中河南懷山藥的提取率最高為9.43%，純度為89.15%。山藥多糖是山藥品質判定的重要理化指標，其含量也直接影響到山藥的生物活性，河南懷山藥作為山藥的道地產區也可能與其多糖含量較高有關系。

表4 4個產地山藥多糖提取率與純度Table 4 Extraction rate and purity of Chinese yam polysaccharide

2.3 山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制試驗

表5為山藥多糖和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制試驗結果。

4個產地的山藥多糖對α-葡萄糖苷酶都有一定抑制活性，隨著質量濃度的增大，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷增加，并呈劑量依賴關系。在相同濃度下，4個產地山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率大小順序為：河南懷山藥＞祁山藥＞安國懷山藥＞廣西山藥。

表5 α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 5 Inhibitory rate of α-glucosidase

2.4 山藥多糖的抗氧化性能

2.4.1 山藥多糖清除DPPH·能力

4種山藥多糖對DPPH·的清除率見圖2。

圖2 4種山藥多糖對DPPH·的清除率Fig.2 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward DPPH·

由圖2可知，隨著山藥多糖質量濃度的增加，山藥多糖對DPPH·的清除率增加，在山藥多糖質量濃度為5.0 mg/mL時，河南懷山藥多糖對DPPH·的清除率可達到71.25%，其次為祁山藥。

2.4.2 山藥多糖清除OH·能力

4種山藥多糖對OH·的清除能力見圖3。

圖3 4種山藥多糖對OH·的清除能力Fig.3 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward OH·

由圖3可知，4種山藥多糖對OH·都有較好的抑制能力，隨著山藥多糖質量濃度的增加，山藥多糖對OH·的清除率增加，當質量濃度為5.0 mg/mL時，河南懷山藥對OH·的清除率可達到88.35%，其次為祁山藥。

2.4.3 山藥多糖清除O2-·能力

4種山藥多糖的O2-·清除能力見圖4。

圖4 4種山藥多糖的O2-·清除能力Fig.4 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward O2-·

由圖4可知，4種山藥多糖對O2-·都有較好的清除能力，隨著質量濃度的增大，多糖對O2-·都有較好的抑制能力不斷增加，當質量濃度為10.0 mg/mL時，山藥多糖對O2-·清除能力增長緩慢，廣西山藥對O2-·清除能力最高為69.81%，其次為祁山藥。

通過試驗表明河南懷山藥多糖含量最高，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用、對DPPH自由基的清除作用均最優，其符合河南為山藥道地產區質優效佳的傳統認知。

3 結論

本試驗采用Box-Behnken設計-響應面法優化了超聲輔助提取山藥多糖的工藝條件：提取溫度為66℃，提取時間為 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），在此條件下，山藥多糖提取率為9.34%。體外試驗研究表明，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶具有較顯著的抑制作用，并呈現一定的濃度依賴性，當4個產地山藥多糖濃度為30 mg/mL，河南懷山藥多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率達到44.03%，其次為懷山藥39.43%。與陽性對照阿卡波糖相比，山藥多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用均低于阿卡波糖，但山藥多糖也顯示出較強的抑制作用。山藥多糖抗氧化活性研究顯示，當山藥多糖濃度為5.0 mg/mL時，河南懷山藥多糖對DPPH·的清除率可達到71.25%；當山藥多糖質量濃度為5.0 mg/mL時，河南懷山藥對OH·的清除率可達到88.35%；當山藥多糖濃度為為10.0 mg/mL時，廣西山藥對O2-·清除能力最高為69.81%。本試驗結果顯示河南懷山藥和祁山藥的品質好，符合河南懷山藥和祁山藥質量優良的道地產區傳統認知。