應用高通量測序技術對東部白松和旱柳葉片表面真菌多樣性的測定1)

陳少鵬 崔亞靜 侯婉晴 莊倩倩 劉穎 呂偉偉

(吉林農業科技學院，吉林省·吉林市，132101) (吉林市林業科學研究院)

園林植物是維護城市生態平衡的重要一環，其生態效益在空氣污染日益嚴重的今天尤顯重要?？諝庵械奈⑸锸且鹑撕粑兰膊〉闹饕蛑籟1]，很多園林植物能通過釋放揮發性有機物來抑制周圍微生物的生長[2]。通常，植物葉片直接與空氣相接觸，面積巨大，因此植物葉片上常吸附著大量的微生物。有研究表明，土壤和葉片是所有地點近地表大氣中重要的微生物來源[3]，但是對于植物葉面微生物的研究還相對較少[4-5]。一些學者對煙草(Nicotianatabacum)[6]、芒果(Mangiferaindica)[7]、紅樹(Lumnitzeralittorea)[8]等葉面微生物的種類、多樣性等方面進行了研究，結果表明不同植物葉片表面有著不同的微生物種群，且對表面吸附的菌種具有一定的選擇性?，F有的研究手段和重點多集中于植物浸提液對真菌、細菌的抑制作用[9-10]，或者是植物對周圍空氣中微生物的影響[11-12]。但是人工提取植物浸出液的方法具有很大的局限性，而因空氣的流通性則很難確定是否是植物影響空氣中的微生物分布，因此這些方法并不能直接說明植物在自然狀態下的除菌能力。所以，直接對植物葉片表面吸附的微生物進行比對研究最能夠說明植物葉片對微生物群落的影響。目前，植物葉片或者根系菌群的分離和鑒定主要采用瓊脂平板擴散、濾紙貼片等方法[13-14]，而這些方法均有費時、低效和不準確等缺點，同時菌的分離和鑒定也較為困難。近些年，隨著分子生物學技術的發展，利用序列分析、熒光定量PCR(RT-PCR)等技術對微生物的種群進行分析鑒定越來越受到重視。一些研究者利用RT-PCR、DNA指紋圖譜和16S rDNA克隆文庫的方法來檢測空氣中細菌的基因結構和微生物多樣性[15-17]。本研究以從加拿大引種的東部白松(Pinusstrobus)和園林綠化中常用的旱柳(Salixmatsudana)葉片為材料，基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序的方法，構建小片段文庫進行測序。通過對Reads拼接過濾、分類操作單元(OTUs)聚類，以真菌的18S rDNA序列和ITS(內轉錄間區)序列進行物種注釋，進一步進行豐富度、多樣性等分析，以期揭示2種樹種葉片表面真菌的物種構成，并為城市園林的生態建設提供理論支持。

1 材料與方法

樣品采集：以吉林農業科技學院園林樹木資源圃中生長健壯、無病蟲害且位置相鄰的5年生的東部白松和旱柳植株為試驗材料，于2018年8月，選擇連續7 d無降水的時間段進行取樣，采樣時間為2018年8月2日上午10：00，取樣點選擇樹木外部臨近街道的中下部葉片，其中旱柳樹高4.5 m，株距5.0 m；東部白松樹高3.0 m，株距4.0 m。每種樹木取樣5 g，取樣后立即放入經高壓滅菌的無菌自封袋中，做好標記后放入保溫箱中(0 ℃)帶回實驗室。每種樹木葉片以相同方式取樣3次，記做3次重復。

DNA提?。簩悠穾Щ貙嶒炇液?，用200 mL無菌水將東部白松和旱柳葉片分別浸泡于無菌瓶中30 min，之后采用超聲波清洗機(預先用體積分數75%酒精擦拭)超聲(室溫24 ℃，超聲頻率25 kHz)15 min，將全部液體轉移至4個50 mL離心管中，室溫在12 000 r·min-1離心5 min，將4管中的沉淀轉移合并至1.5 mL離心管中。采用真菌總DNA提取試劑盒(OMEGA,USA)進行真菌DNA的提取。真菌總DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用超微量紫外光分光光度計(NanoPhotometerTMP-Class,USA)測定OD值，A260/A280在1.70～1.90，DNA質量濃度為100 μg·L-1以上，滿足后續試驗要求，于冰箱中-80 ℃保存。

建庫測序：提取東部白松和旱柳表面真菌總DNA后，根據保守區設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，然后經過PCR擴增，將單一條帶切膠回收后，進行文庫質檢，之后采用Illumina HiSeq 2500進行測序。

OTU分析及物種注釋：使用QIIME[18](1.8.0版)軟件中的UCLUST[19]對測序獲得的序列在97%的相似度水平下進行聚類并獲得OTU，再與真菌分類學數據庫(UNITE，http://unite.ut.ee/index.php)進行比對，最終在門、綱、目、科、屬、種層面上進行分類學注釋。

數據分析：物種注釋、Alpha多樣性、Simpson指數、Shannon指數等分析采用KRONA、Mothur(v.1.30版，http://www.mothur.org/)等軟件進行分析，繪圖采用Excel、R語言。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量

通過統計各階段東部白松葉片真菌(編號：M01)和旱柳葉片真菌(編號：M02)DNA測序的序列數目，用以評估測序數據質量(表1)。從表1可見，M01和M02經Illumina HiSeq 2500測序后獲得的雙端測序序列分別有731 681、1 045 005條，通過雙端拼接、過濾優化后獲得有效數據分別為604 110、865 093條，占全部所測序列的82.56%和82.78%。M01平均序列長度為230 bp，Q30質量為97.68，大于80%；M02平均序列長度為236 bp，Q30質量為97.62，大于80%，說明測序質量合格，可以進行后續分析。

表1 東部白松和旱柳葉片真菌測序數據處理結果

注：Q30為堿基識別精度大于99.9%的堿基數目占總堿基數目的比例。

2.2 物種注釋及分類

2.2.1 物種分類統計

M01包含已經注釋的真菌分為3門、16綱、36目、65科、72屬總計75種。而M02包含已經注釋的真菌分為3門、16綱、33目、60科、78屬總計75種。在目和屬分類級別上M02優于M01，在科級別上則弱于M01。在已經標注的M01和M02樣品中，在種分類水平下共同種為65種，占比86.67%；差異種為10種，占比13.33%。

2.2.2 物種相對豐富度

為了使結果表現更為清晰，僅顯示豐度水平前10的物種，并將其他物種合并為其他，未分類和未分配用以代表在該分類級別上未得到分類學注釋的物種。根據Zhu et al.的分類方法，將相對豐度高于10.00%定義為優勢菌群，而相對豐度低于0.01%定義為稀有菌群[20]。由表2可見，在門分類級別上M01和M02的優勢菌群主要為子囊菌門(Ascomycota)，相對豐富度達85.12%，其次為擔子菌亞門(Basidiomycota)；在綱分類水平上M01和M02優勢菌群主要為座囊菌綱(Dothideomycetes)，相對豐富度達72.00%以上，而M02外擔菌綱(Exobasidiomycetes)的相對豐富度高于M01，M01酵母綱(Saccharomycetes)的相對豐富度則遠高于M02；在目分類級別上M01和M02的優勢菌群主要為格孢腔菌目(Pleosporales)、煤炱目(Capnodiales)和座囊菌目(Dothideales)，其中M01的裂殖酵母目(Saccharomycetales)相對豐富度為9.69%，遠高于M02，二者相差27598倍；在科分類水平上枝孢霉科(Cladosporiaceae)、外擔菌科(Aureobasidiaceae)、小雙腔菌科(Didymellaceae)為M01和M02的優勢菌群，而假球殼科(Pleosporaceae)為M02優勢菌群，裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)則僅在M01中發現；在屬分類水平上枝孢菌屬(Cladosporium)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、鏈格孢屬(Alternaria)為M01和M02的優勢菌群，念珠菌屬(Candida)僅存在于M01；在種分類水平上皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)為M01和M02的優勢菌群，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)僅存在于M01，M01中異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)的相對豐富度遠高于M02。

表2 東部白松和旱柳葉片真菌自然分類系統的相對豐富度

續(表2)

2.3 多樣性

在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數見表3。Alpha多樣性中的Chao1和ACE指數可衡量物種豐度即物種數量的多少。Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性[21]。從表3可見，M02的OTU數量高于M01，Chao1和ACE也高于M01。Simpson指數M01高于M02，Shannon指數M02高于M01。M01和M02的文庫覆蓋率均為1，說明M01和M02的物種均被測出。由圖1A可知，M01、M02分別在Shannon指數為2.56和2.71時曲線趨于平坦，說明OTU種類不會隨測序量增加而增長。M02大于M01，說明M02的物種比M01更加豐富。由圖1B可知，M02在物種的組成豐富度上優于M01(橫軸)，而M01的曲線與M02相比較更加的平滑，說明M01物種組成的均勻度更好。

表3 東部白松和旱柳葉片真菌多樣性指數

圖1 東部白松和旱柳葉片真菌Shannon指數和相對豐富度曲線

3 結論與討論

對東部白松和旱柳葉片表面真菌群落多樣性的研究結果表明，東部白松葉片表面包含的真菌分為3門、16綱、36目、65科、72屬總計75種；旱柳真菌分為3門、16綱、33目、60科、78屬總計75種。東部白松葉片表面真菌的Simpson指數大于旱柳，而旱柳葉片表面真菌的Shannon指數大于東部白松，旱柳的葉片表面真菌物種豐富度更高，但是東部白松葉片表面真菌的均勻度更高。

目前，葉表面微生物多樣性及生態學的研究主要集中在具有特定目標的微生物上，Beattie et al.對豆葉片上假單胞菌(Pseudomonassyningae)在不同環境條件下的存活、生長和定位進行了研究[22]，而Jackson et al.則針對南方木蘭(Magnoliagrandiflora)葉綠體細菌進行了研究[23]。國外學者對葉面上的附生種群研究較多，Ercolani對不同樹齡和不同月份的橄欖(Canariumalbum)葉片上的細菌進行了分離鑒定，認為同齡葉片上的細菌菌群結構非常相似，但是不同齡的葉片菌群則差異較大[24]；在對苦苣(Cichoriumendivia)葉片表面的細菌種群進行研究時發現，微環境和環境條件之間的相互作用以及葉片的生理條件對附生細菌種群大小有著顯著的影響[25]。本研究結果表明，東部白松和旱柳葉片表面真菌種群數目均為75種，二者在門、綱、目、科、屬、種分類水平上的優勢菌群較為類似，均有相同的優勢種群，如枝孢菌屬和鏈格孢屬。一些研究也表明，枝孢菌屬和鏈格孢屬是很多高等植物葉片表面的優勢菌群[26-27]，這得益于它們良好的傳播性[28]。但是東部白松和旱柳在一些真菌種群上則體現出了一定的選擇性。酵母綱、裂殖酵母目、裂殖酵母科僅在東部白松上為優勢種群，而在旱柳上則為劣勢種群，二者豐富度相差20 000多倍，這說明東部白松對酵母類的真菌具有更好的選擇性。Collins et al.在挪威云杉(Piceaabies)葉片上能夠觀察到大量酵母菌，而且在整個挪威云杉生長季中酵母菌的數量變化較小[29]，與本研究結果類似，這有可能說明酵母菌類更容易吸附在針葉樹種葉片表面，如：熱帶假絲酵母、異常威克漢姆酵母和克魯維畢赤酵母。旱柳與東部白松葉片真菌種類相比較，旱柳在各個分類水平上的相對豐富度并不突出，但是在物種多樣性上優于東部白松。在物種多樣性分析中，Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高[21]。旱柳的Shannon指數值高于東部白松，Simpson指數值低于東部白松，這說明旱柳葉片表面的真菌種群多樣性高于東部白松，物種豐富度曲線也表現出相同的結果。這種針葉樹種和闊葉樹種葉片表面真菌群落多樣性的差距可能是由于二者葉片表面結構的不同所導致的，但是沒有相關文獻直接指出不同葉片表面結構對微生物種群有影響。此外，針對熱帶大西洋植物樹冠葉片表面微生物多樣性的研究發現，不同的微生物群落會選擇不同的植物[30]；Yang et al.發現微生物群落結構在相同植物物種的不同個體上相似，但在不同植物物種上是獨特的[31]，這些研究結果與本研究結果類似。