虎奶菇菌絲體細胞壁成分分析及多糖結構表征

葛夢蝶，代安然，楊崇婧，劉京京，CHEUNG Chi Keung Peter ，陳磊*

1(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(香港中文大學 生命科學學院，中國 香港，999077)

虎奶菇(Pleurotustuber-regium, PTR)是食藥兩用擔子菌，富含蛋白、多糖等營養成分及多種活性物質，常被用來治療頭痛、胃痛、發燒以及哮喘、天花和高血壓[1-2]等多種疾病。研究表明，從PTR菌核和菌絲體中提取的非淀粉多糖和多糖-蛋白復合物除了具有多種營養價值外，還具有免疫調節和癌細胞殺傷作用[3-4]。這些活性成分主要存在于PTR的細胞壁中，在前期研究中，通過對PTR 菌核細胞壁可溶性多糖的分離和鑒定，初步闡明了菌核細胞壁的骨架結構[5]，即超支化β-葡聚糖，這類多糖因特殊的超支化結構和準球狀空間形態而具有良好的可溶性、高分散性及大量可用于改性的末端基團，因而在高分子材料、生物醫學以及緩釋材料等領域具有巨大的應用潛力[6]。

虎奶菇的生長周期主要包括菌絲體、菌核和子實體3個階段，菌核作為PTR的特殊生長階段，生長條件較為苛刻，獲取不易，因此這類超支化多糖的研究和應用也受到了極大限制。作為虎奶菇生長初始階段的菌絲體，更易于通過發酵等手段獲取，但其細胞壁(Pleurotustuber-regiummycelium cell wall, PTR-MCW)的結構信息尚不清楚，價值還亟待開發。因此，有必要對PTR-MCW的組成和結構進行研究，為進一步開發虎奶菇高附加值產品提供理論依據。本文通過不同提取方式對PTR-MCW成分進行分離及成分分析，并對主要可溶性細胞壁多糖進行結構表征，為進一步開發虎奶菇資源打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

PTR，購于美國Fungi Perfecti有限公司；馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.2 實驗試劑

酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司；BCA法蛋白濃度測定試劑盒(增強版)，碧云天生物技術有限公司；單糖標品(98%阿拉伯糖、99%巖藻糖、99%半乳糖、98%葡萄糖胺、色譜純葡萄糖、99%甘露糖、98%鼠李糖、98%木糖)、99.7%二甲基亞砜、99%肌醇、99.9%二氯甲烷，百靈威科技有限公司；99.5%碘甲烷，梯希愛化成工業發展有限公司；色譜純甲醇，瑞典歐森巴克化學公司；苯甲基磺酰氟(phenymethylsulfonyl fluuoried，PMSF)，上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

HH·B11·360型電熱恒溫培養箱，連云港醫療器械設備廠；7GI-16M型臺式離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；HYG-A型全溫搖床柜，太倉市實驗設備廠；FA-1004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；RE 52-3型旋轉蒸發器，上海滬西分析儀器廠；Enspire 2300型多標記檢測系統(酶標儀)，美國珀金埃爾默有限公司；CRX3HD型冷凍干燥機，日本日立公司；NDK200-2型氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；EASY-LOAD型Pall minimate切向流超濾系統，頗爾公司；TSQ 8000型三重四級桿氣質聯用，美國賽默飛世爾科技有限公司；DAWN HELEOS Ⅱ型多角度激光光散射凝膠色譜系統(SEC-MALLS)，美國懷雅特技術公司；NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，美國尼高力儀器公司；SU8220型冷場發射掃描電子顯微鏡(SEM)、H-7650型透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立公司。

色譜柱填料及裝柱參數為Sephacryl S-1000(90 cm×2.6 cm i.d.)，Sephacryl S-400(90 cm×2.6 cm i.d.)，Sephacryl S-200(70 cm×2.6 cm i.d.)，Sephadex G10(70 cm×2.6 cm i.d.)，英國安發瑪西亞生物技術公司，填料為GE-HealthCare。

1.2 實驗方法

1.2.1 PTR菌絲體的發酵與細胞壁制備

虎奶菇接種于PDA平板上，30 ℃培養7 d，4 ℃保藏，定期進行轉接。

從長滿虎奶菇菌絲的PDA平板上切下10片約1 cm2的小塊，加入到裝有200 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r/min條件下搖床培養3 d，制備種子液。將發酵好的種子液以5%的接種量轉接到裝有190 mL發酵液的500 mL的三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下搖瓶培養6 d。種子培養基與發酵培養基配方均為(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉4、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.6，pH自然。

發酵完成后，取發酵液用尼龍紗布過濾分離，并用去離子水洗滌菌絲體，至洗液為無色，抽濾去除多余的水分后，-80 ℃冷凍過夜并真空冷凍干燥。取適量凍干后的菌絲體，粉碎過35目篩(0.5 mm)。粉碎后的PTR菌絲體分別先后用A液(1 mmol/L PMSF)、B液(50 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)、C液(20 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)、D液(10 g/L NaCl，1 mmol/L PMSF)洗滌，接著再用A液洗滌以除去胞內雜質，結束后再用超純水洗滌沉淀數次以除去殘留物，離心收集沉淀，冷凍干燥即得PTR-MCW。

1.2.2 PTR菌絲體細胞壁組分的分離與純化

PTR-MCW組分的分離純化方案如圖1所示，凍干的PTR-MCW粉末分別用熱水(100 ℃)、常溫堿溶液(0.5、1 mol/L NaOH)、熱堿溶液(1 mol/L NaOH，80 ℃)浸提，每種提取液均離心(4 ℃，4 000×g，10 min)取上清，分別命名為MHW、MCA-1、MCA-2和MHA，最后剩下的沉淀為堿不溶物MAI。提取步驟均重復5次，合并相應提取液。

將熱水提取液混合濃縮至1/5體積后按體積比1∶4攪拌加入無水乙醇靜置過夜，離心收集沉淀得到MHW；3種堿提組分(MCA-1、MCA-2和MHA)經醋酸溶液中和后，分別按1∶3的體積比加入無水乙醇靜置過夜，離心收集沉淀，再分別用75%(體積分數)酒精洗滌沉淀8次；MAI用雙蒸水洗滌至中性以除去化學殘留。

用截留量為10 kDa的超濾膜對堿溶性組分作初步純化，得到分子質量分別大于10 kDa(MCA-1I、MCA-2I和MHA-I)和小于10 kDa(MCA-1Ⅱ、MCA-2Ⅱ、MHA-Ⅱ)的兩類組分。對于MCA-1I、MCA-2I和MHA-I，采用在Sephacryl S-1000色譜柱與Sephacryl S-400色譜柱聯用分離，以0.2 mol/L NaCl溶液為洗脫液在1.5 mL/min的速度洗脫純化，收集合并相應組分。MCA-1Ⅱ、MCA-2Ⅱ和MHA-Ⅱ通過Sephacryl S-200色譜柱用同樣的洗脫液和流速進行洗脫，進一步純化為單一組分。所有純化的組分分別合并后過Sephadex G10色譜柱用超純水洗脫除鹽，冷凍干燥。

圖1 PTR菌絲體組分的分離純化步驟

1.2.3 PTR-MCW組分分析

1.2.3.1 PTR-MCW組分化學成分分析

總糖、糖醛酸和蛋白含量的測定分別采用苯酚-硫酸法[7]、硫酸-間羥基聯苯法[8]和 BCA法[9]。

精確稱取10 mg純化的多糖以硫酸水解，取水解后的樣品及標準品分別用硼氫化鈉還原，并用乙酸終止反應；再加入1-甲基咪唑和乙酸酐進行單糖的衍生化，之后用二氯甲烷進行萃取，GC-MS上機分析單糖組成[10]。GC-MS條件如下：色譜柱Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS GC Columns(30 m×0.25 mm i.d., 0.25 μm 濾膜)；載氣為氦氣；升溫程序為50 ℃、1 min、50～150 ℃(10 ℃/min)、150～200 ℃(1 ℃/min)、200～280 ℃(20 ℃/min)、280 ℃持續5 min；MS條件為離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，檢測器電壓1.5 kV，質量掃描范圍33～550。

1.2.3.2 糖苷鍵構成分析

多糖的糖苷鍵構成采用甲基化衍生結合GC-MS分析的方法[11]，稱取干燥的多糖樣品3 mg依次加入200 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、100 μg NaOH粉末，吹吸混勻；加入碘甲烷進行甲基化反應3 h，用超純水終止反應，然后用二氯甲烷進行萃取，氮氣吹干；經水解、還原后，進行乙?；苌?，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯(partially methylated alditol acetates，PMAAs)，之后用二氯甲烷進行萃取，GC-MS上機分析。GC-MS條件如下，色譜柱Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS GC Columns(30 m×0.25 mm i.d., 0.25 μm 濾膜)；載氣為氦氣；升溫程序為50 ℃ 2 min、50～150 ℃(20 ℃/min)、150～200 ℃(3 ℃/min)、200～280 ℃(20 ℃/min)、280 ℃持續7 min；MS條件為：離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，探測器電壓1.5 kV，質量掃描范圍33～550。

1.2.3.3 多糖的FT-IR分析

稱取1 mg多糖樣品，充分干燥后采用KBr壓片法[12]進行傅里葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.3.4 多糖分子量及分子構象分析

采用多角度激光光散射凝膠色譜系統(size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering，SEC-MALLS)分析多糖的重均分子量(weight-average molecular mass，Mw)、均方根半徑(root mean square radius, R.M.S. radius，又稱回轉半徑，Radius of gyration,rg)[13]。MALLS光源為He-Ne激光源，波長為690 nm。所用凝膠柱為Ultrahydrogel@TM 2000(30 cm×7.8 mm i.d.)，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液(用0.2 μm濾膜過濾，并且超聲脫氣),流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃。取經脫氣處理的流動相溶解多糖樣品，樣品質量濃度為1 g/L。Astra軟件用于實驗數據采集與結果分析。

采用Zimm擬合法及公式(1)進行數據處理[14]，即可得到多糖的Mw、R.M.S. radius等參數:

(1)

1.2.4 電鏡分析

對1.2.1中粉碎過篩的虎奶菇菌絲體粉末、菌絲體細胞壁PTR-MCW及純化并凍干后的MHA-I粉末進行SEM分析。取適量樣品粉末，使其分散在樣品板上，清除不被黏附的樣品粉末，使得樣品板上僅保留薄薄的一層待測樣品，噴金后在10.0 kV下進行SEM觀察[15]。為了進一步觀測MHA-I的微觀形態，將其充分分散溶解后進行TEM分析。將MHA-I多糖樣品制成1 g/L的水溶液，與等體積1 g/L的SDS溶液混合，80 ℃加熱2 h，梯度稀釋至5 μg/mL，再80 ℃加熱2 h，將樣品滴在200目的多孔碳膜上，室溫環境下干燥，80 kV下進行TEM觀察[16]。

1.2.5 數據處理

所有試驗均采用3次平行設計(n=3)，試驗數據采用Sigma plot 14.0軟件進行統計和作圖。

2 結果與分析

2.1 PTR菌絲體細胞壁的含量與組成

采用不同的溶劑對PTR-MCW進行提取分離，得到的組分及含量如表1所示。菌絲體細胞壁僅占干重(dry weight，DW)的(19.1±0.3)%，明顯低于菌核[(78.4±0.7)% DW][5]和子實體[(46.6±0.9)% DW][10]，說明PTR在不同生長階段的細胞壁構成及形態特征具有明顯差異。由表1可知，PTR菌絲體細胞壁中碳水化合物質量分數為79.0%，糖醛酸質量分數為5.06%，蛋白質質量分數為3.79%，各成分的比例與虎奶菇菌核和子實體中相應組分含量一致[5, 10]。

MCW分離后，熱水提部分(MHW)占細胞壁的2.06%，其中蛋白質質量分數為55.61%，而總糖質量分數為41.3%(表1)。因此，菌絲細胞壁中可能含有少量水溶性蛋白質、多糖或糖蛋白組分。堿提組分(MCA-1、MCA-2和MHA)主要由碳水化合物和微量的糖醛酸組成，其中常溫堿提組分(MCA-1、MCA-2)和熱堿提組分(MHA)的含量分別占細胞壁干重22.06%和46.97%，與之前測定的PTR子實體細胞壁中相應組分含量(子實體常溫堿提組分FCA和子實體熱堿提組分FHA分別為20.5%和52.4%)接近[10]，但與PTR菌核細胞壁中相應組分的質量分數(菌核常溫堿提組分SCA和菌核熱堿提組分SHA分別為41.2%和35.3%)[5]差異較大。此外，堿不溶性組分(MAI)中可測到的碳水化合物質量分數僅為45.7%，未檢測到糖醛酸和蛋白質。

根據以上結果和溶劑提取強度順序(由弱到強)，預測PTR-MCW成分由外層到內層依次為水提多糖、蛋白質或糖蛋白，堿提多糖，不溶性多糖-幾丁質復合物。

表1 PTR菌絲體細胞壁的組成成分 單位：%(質量分數)

注：a，苯酚-硫酸法檢測不到幾丁質中的葡萄糖胺[17]；-代表無(下同)

由于細胞壁分離過程采用由弱到強的溶劑提取強度，以過往文獻記載，所提取到細胞壁組分的順序依次由外而內[18]。由此推斷，PTR-MCW組分由外而內的順序為MHW、MCA-1I、MCA-2I、MHA-I、MAI。PTR-MCW水溶性粗提物含量較低，且含有大量的蛋白質，所以對于MHW不進行進一步純化，只分析其單糖組成；堿溶性組分經超濾膜純化后，得到分子量較大的組分MCA-1I、MCA-2I和MHA-I，柱層析法進行純化之后，分別從MCA-1I、MCA-2I和MHA-I中獲得單一組分。對于分子量較小的組分MCA-1Ⅱ, MCA-2Ⅱ和MHA-Ⅱ，柱層析純化之后，收集到樣品含量極低。因此，純化MCW多糖的分析主要集中于3種占主要成分的大分子可溶性組分MCA-1I、MCA-2I和 MHA-I。

2.2 細胞壁多糖的結構分析

2.2.1 PTR菌絲體細胞壁多糖的制備與組分分析

經檢測，純化多糖中不含糖醛酸，因此乙?；苌蟛捎肎C-MS檢測單糖組成。如表2所示[19]，水提物MHW中含有較多的甘露糖、木糖、鼠李糖和半乳糖，隨溶劑提取強度的增強，上述幾種單糖組成含量依次降低，而葡萄糖含量逐步增加，具有明顯的規律性。相比之下，不溶性組分MAI除含有質量分數為41.90%葡萄糖外，還含有58.10%的氨基葡萄糖(幾丁質的結構亞基)。因此，MAI由葡聚糖-幾丁質復合物組成[20]。

表2 PTR菌絲體細胞壁組分的單糖組成 單位：%(質量分數)

2.2.2 糖苷鍵構成分析

由于MCA-1I和MCA-2I在DMSO中的溶解度很低，無法順利進行甲基化衍生和糖苷鍵構成分析，所以只對PTR-MCW的主要多糖組分MHA-I進行糖苷鍵構成分析。將GC-MS總離子色譜圖(total ions chromatograph，TIC)中不同峰的質譜圖與CCRC在線數據庫中的標準質譜圖比對[21]，對MHA-I中糖苷鍵類型進行鑒定(表3)，再根據TIC中單糖的峰面積和響應因子計算單糖殘基的摩爾比[22]。

由質譜數據分析結果(表3)可知，MHA-I主要由T-葡萄糖(末端葡萄糖)、1,3-葡萄糖、1,4-葡萄糖、1,6-葡萄糖、1,3,6-葡萄糖和1,4,6-葡萄糖組成，此外，還含有少量T-木糖(末端木糖)、T-鼠李糖(末端鼠李糖)、1,3,6-甘露糖。其中鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖的質量分數分別為0.7%、1.2%、2.9%和95.3%，此結果與單糖組成分析結果一致(表2)。

分支度的計算公式為DB= (NT+NB)/(NT+NB+NL)[23]，其中NT、NB和NL分別指末端殘基、分支殘基和線性殘基的摩爾量，經計算，MHA-I的DB值為0.45，因此認為MHA-I是一種超支化的雜多糖。

表3 甲基化分析MHA-I中糖苷鍵峰面積和摩爾比

注：a,T-Xylp, 末端吡喃木糖；T-Rhap, 末端吡喃鼠李糖；T-Glcp, 末端吡喃葡萄糖；Manp, 吡喃甘露糖；b,TU/BP (terminal units/branching points),末端單元/分支單元；c,DB (degree of branching),分支度

2.2.3 紅外光譜分析

MHA-I的紅外光譜如圖2所示，在3 200～3 500 cm-1、2 700～3 000 cm-1、1 000～1 800 cm-1均有強吸收峰。其中，3 383 cm-1處的寬峰為—OH的伸縮振動，2 891 cm-1處的吸收峰是C—H的振動，1 638 cm-1處的吸收峰是由于羰基C—O—C鍵的伸縮振動，1 072、1 042 cm-1處的吸收峰表明MHA-I是吡喃糖905 cm-1處有吸收峰表明,MHA-I含有β-吡喃糖苷鍵[24]。

圖2 MHA-I的紅外光譜圖

2.2.4 MHA-I分子量及分子構象

采用分子排阻色譜-多角度激光光散射聯用系統(SEC-MALLS)測定多糖的分子量分布及多糖分子的構象信息。如圖3所示，對稱性較好的單峰表明MHA-I組分單一，具有較高的純度(99.92%)；圖4顯示純化多糖MHA-I的(Rθ/Kc)c=0角度依賴關系。

圖3 MHA-I的SEC-MALLS色譜圖

圖4 MHA-I的(Rθ/Kc)c=0值與光散射角度的關系

MHA-I是從占細胞壁干重46.97%的MHA中純化出的主要組分，表明該組分構成PTR-MCW的骨架。根據公式(1)和圖4計算得到，MHA-I的Mw為4.502×104g/mol(表4)，由圖4的角度依賴的斜率得出R.M.S. 半徑為33.2 nm。多分散系數(polydispersity index, PDI)反映了分子Mw的均一性，可由Mw/Mn計算得到，對于單分散分子，其值接近于1[25]。表4中Mw/Mn=1.154表明MHA-I具有較高的純度。分形維數(df)是評價聚合物結構致密性的參數，df值越大，聚合物結構越致密。剛性桿或棒狀結構分子的df值為1，無規則卷曲的線性聚合物的df值在5/3～2。分支殘基越多，其df值越大，df=3代表具有理想三維空間結構的高分子[26]。df值可以根據公式(2)、公式(3)確定：

(2)

df=1/v

(3)

式中：指數v反映了聚合物的分子形狀，當其值為0.33、0.50～0.60和1.0，分別表示球體、隨機線圈和剛性桿的分子形狀[27]。MHA-I的v值為0.37，對應的df值為2.69(表4)，表明MHA-I的構象接近球形。

表4 MHA-I的SEC-MALLS分析結果

注：Mn，數均分子量；df，分形維數

與PTR菌核、子實體細胞壁(分別為SCA-I、FHA-I)[5, 10]多糖相比，MHA-I的Mw相對較小，且單糖組成較復雜，但是它們都被鑒定為超支化多糖；此外，糖苷鍵構成分析發現，SCA-I、FHA-I和MHA-I中主要的糖苷鍵類型一致，但MHA-I中含有更多其他類型的末端殘基。

2.2.5 菌絲體及細胞壁形態觀察

為了直觀觀測虎奶菇菌絲體及其細胞壁主要組分的微觀形態，將相應組分進行電鏡觀測(圖5)。由虎奶菇菌絲體粉碎后的SEM圖像(圖5-a)可知，粉碎過篩后斷裂均勻，呈現表面形貌光滑的管狀結構；與完整的菌絲體相比，細胞壁由于失去了胞內物質的支撐，并且在洗滌提取過程中經過了溶劑等的破壞作用而呈現表面粗糙的片狀結構(圖5-b)。而作為細胞壁的主要構成組分MHA-I在凍干后的SEM圖像則呈現準球形的顆粒狀態(圖5-c)，結果與SEC-MALLS結果一致。為了進一步觀察MHA-I的微觀形態，將其用SDS溶液溶解分散后以TEM觀察，如圖5-d所示，MHA-I分子為舒展的高分支聚合物，該結果與甲基化結果一致。因此，MHA-I組分為具有超支化結構特征的雜多糖聚合物，在干燥的粉末狀態下和水溶液中呈現準球形，這也是超支化多糖的特點之一。

基于以上實驗結果，初步預測PTR菌絲體細胞壁的結構為：細胞壁表面主要是可用沸水提取的蛋白，多糖和/或聚糖-蛋白復合物；細胞壁的第二部分是以葡萄糖為主的雜多糖，可以用不同濃度的常溫堿溶液提??；第三組分由于含量較高，可認為是菌絲細胞壁的結構骨架，主要由具有超支化結構的葡聚糖構成，另含有少量的甘露糖、木糖和鼠李糖，可用80 ℃熱堿溶液提??；葡聚糖和幾丁質的復合物形成了細胞壁的第四部分，即使熱堿溶液也不能將其從菌絲細胞壁中提取出來。

PTR-CWM的結構骨架與其子實體[10]類似，但超支化葡聚糖骨架中含有少量甘露糖、木糖等組分。與雙孢菇菌絲體細胞壁[28]結構相比，它們菌絲體細胞壁的內層均為堿不溶性的多糖-幾丁質復合物。不同的是，PTR-MCW的糖蛋白組分更多地集中于細胞壁的外層，而在雙孢菇中糖蛋白貫穿整個菌絲體細胞壁；此外，雙孢菇菌絲體細胞壁中的堿溶性多糖主要是葡聚糖，而PTR中是以葡聚糖為主的超支化雜多糖。

3 結論

本研究通過采用不同溶劑對PTR-MCW組分進行分離，得到4種細胞壁組分，分別為MHW、MCA、MHA、MAI，其比例為2.06∶22.06∶46.97∶18.95。從細胞壁主要組分MHA中純化出的多糖MHA-I主要含有葡萄糖和少量甘露糖、木糖、鼠李糖。甲基化分析及FT-IR表明，MHA-I含有T-葡萄糖、1,4-葡萄糖、1,6-葡萄糖、1,3,6-葡萄糖等9種β-糖苷鍵，DB計算為0.45。結合SEC-MALLS分析結果可知，MHA-I為一種具有超支化結構的雜多糖，其分子量和半徑分別為4.502×104g/mol、33.2 nm。電鏡分析證實了MHA-I的超支化結構，而且該多糖在干燥的粉末狀態下呈現準球形結構。本研究結果為探究細胞壁結構提供了新的思路和方法，PTR菌絲體作為一種重要的膳食纖維的來源，在食品工業等領域具有廣泛的研究價值。