羅伊氏乳酸桿菌SL001對AD模型小鼠和C57BL/6小鼠腸道微生物的影響

劉梅梅，胡汝倩，郭耀文，孫衛忠，李建濤，范明亮，王燕，杜華茂，唐志如，柴春利

1 西南大學 生物技術學院，重慶 400715

2 西南大學 動物科技學院，重慶 400715

阿爾茨海默癥 (Alzheimer’s disease，AD) 是一種神經退行性疾病，具有年齡相關性，其臨床表現為進行性認知障礙，始于記憶力的惡化，影響正常生活并最終導致殘疾甚至死亡[1-3]。目前對AD的發病機制主要有兩個假說：Aβ沉積假說和Tau蛋白過度磷酸化假說[4-5]。令人遺憾的是，目前以這兩種假說為中心的治療策略持續失敗。最近，越來越多的研究表明，腸道微生物 (Gut microbes，GM) 與AD之間存在緊密的聯系[6-8]。與常規飼養的AD模型小鼠相比，無菌AD模型小鼠表現出異常的腸胃蠕動，并且腦中Aβ沉積急劇降低。將常規飼養的AD模型小鼠的糞便微生物菌群定殖到無菌AD模型小鼠中，小鼠腦中的Aβ水平增加。相比之下，來自對照野生型小鼠的微生物群定殖卻不會造成Aβ水平的增加[9]。長期的廣譜抗生素治療也可使AD模型小鼠的腸道微生物多樣性發生紊亂，進而引發腦部Aβ斑塊沉積和小膠質細胞形態發生改變[10]。近來的臨床試驗表明，幽門螺桿菌Helicobacter pylori感染的AD患者具有更嚴重的認知障礙，根除幽門螺桿菌可以延長AD患者的生存期[11]。GV-971藥物已通過臨床Ⅲ期試驗，發現其可以重塑AD患者的腸道微生物，降低大腦的炎癥反應，進而改善了認知功能的下降[12]，該結果進一步證明了腸道微生物在AD發展中的重要作用，因此可以將GM作為AD治療的潛在新靶標。

益生菌作為生物治療劑具有改善腸道環境、抗肥胖、預防癌癥和感染等功效[13-14]。一些益生菌也可以通過微生物-腸-腦軸 (Microbe-gut-brain axis，MGB) 影響中樞神經系統 (Central nervous system，CNS)。MGB軸是一種雙向通訊系統，而作為MGB軸核心的微生物，可通過神經、內分泌、代謝和免疫途徑影響中樞神經系統[15]。已有研究結果顯示一部分乳酸桿菌可以影響腸道神經元的興奮性和結腸運動性，并且降低血漿中炎癥因子水平，緩解小鼠的焦慮行為[16]。在AD患者腦內檢測到γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 濃度的降低，而短乳桿菌和齒狀雙歧桿菌可通過谷氨酸代謝途徑產生GABA，增加其在腦內的含量，減少神經損傷[17]。益生菌治療還可以挽救AD模型小鼠的認知缺陷，改善某些代謝狀態[18]。綜上所述，某些益生菌可能能夠安全有效地治療AD。

在本研究中，我們對AD模型小鼠與野生型小鼠的腸道微生物群落差異進行了調查，并分析添食羅伊氏乳酸桿菌SL001 (Lactobacillus reuteriSL001，L.reuteriSL001) 對兩種小鼠腸道微生物菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 羅伊氏乳酸桿菌SL001菌液制備

L.reuteriSL001 (NCBI登錄號KU255544.1；菌種保藏號CCTCC M 2019122) 為本實驗室前期從家兔胃液內容物中篩選所得。該菌株為革蘭氏陽性桿狀細菌，在MRS培養基上呈白色圓形，中央凸起，邊緣整齊。同時，該菌株具有耐酸、耐膽鹽、分解膽固醇的特點。在MRS培養基中培養L.reuteriSL001，離心收集細胞沉淀，并用PBS (pH 7.4) 洗滌。將收集的沉淀物以5×1011CFU/mL的濃度重懸于PBS中以供實驗使用。

1.2 動物試驗

APP/PS1雙轉基因小鼠 (C57BL/6 background)購于南京大學模式動物研究所，野生型 (C57BL/6品系) 小鼠購自重慶中醫藥研究院。將7月齡20 g左右的雄性APP/PS1雙轉基因小鼠和野生型小鼠隨機分為4組，每組5只：AD小鼠添食組 (PT)、AD小鼠未添食組 (PC)、野生型小鼠添食組 (NT)、野生型小鼠未添食組 (NC)。添食組小鼠每天用0.2 mL的L.reuteriSL001菌懸液灌胃，未添食組則每天接受等量的無菌PBS，每天早上9點通過口服管飼法進行給物處理，周期為45 d。將小鼠分籠飼養，室內適度通風，室溫25 ℃，12 h光照/12 h黑暗循環，自由飲用食物和水。

1.3 小鼠糞便16S rRNA

添食結束后所有小鼠禁食12 h，經乙醚麻醉后解剖，取直腸糞便，液氮凍存以備使用。采用TIANamp基因組提取試劑盒 (TIANGEN Biotech LTD) 提取小鼠糞便DNA，PCR擴增16S rRNA V3–V4片段，引物序列為341-F (5′-CCTAYGGG RBGCASCAG-3′) 和806-R (5′-GGACTACNNGG GTATCT-3′)[19-20]。反應條件：預變性98 1 min℃；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃最終延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒 (Qiagen，Germany)純化目的片段，送北京諾禾致源生物有限公司用Illumina MiSeq 250平臺測序。

1.4 小鼠腸道菌群分析

16S rRNA測序后拼接成Tag，并根據Tag進行物種分類、OTU分析、多樣性分析和多樣品的比較分析等。利用Mothur對測序序列進行去冗余處理，使用基于Naive Bayesian的分類器RDP Classi-fier工具對Tag進行物種注釋。計算97%相似度下的OTU數量，并根據眾數原則對OTU進行物種注釋。采用PICRUSt進行OTU pathway注釋，以Mothur進行樣品α多樣性分析；采用R軟件進行熱圖分析、β多樣性分析、樣品聚類分析和維恩圖的繪制；采用SPSS 21軟件中的雙因素方差分析檢驗兩個處理組之間的統計學差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 結果與分析

2.1 測序數據

經整理，4個處理組20只小鼠腸道微生物的16S rRNA基因擴增子的Illumina MiSeq 250測序對樣品產生84 694–100 129個原始讀數。在質量過濾和去除嵌合序列后，每個樣品保留80 010–92 264個讀數，以97%相似度劃分，可以分配給1 176個OTUs。根據OTU數據，繪制稀疏曲線，由圖1可以看出，稀疏曲線的末端趨于平坦并且在0.03相異截止值下，所有樣品的測序深度指數覆蓋率均高于99.7% (表1)。這些結果表明我們的抽樣量充分，并且測序結果捕獲了小鼠腸道微生物群落的大部分多樣性。根據物種注釋的結果，將來自小鼠糞便樣本中所有的OTU分為對應的域，包括了19個門、40個綱、64個目、104個科和175個屬。由表1可以看出，OTU數目NT 組>PT組>PC組>NC組，表明添食L.reuteriSL001可以增加小鼠腸道微生物種類。

圖1 樣品物種的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve analyses of sample.

2.2 小鼠腸道細菌群落的多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

由表1可知，在ACE、Chao1、Shannon、Simpson等α多樣性指數中，NT>NC，PT>PC，這揭示了添食L.reuteriSL001可以增加小鼠腸道菌群的多樣性。在PC與NC中，前者ACE、Chao1、Shannon、Simpson等α多樣性指數更高，表明未添食AD模型小鼠的腸道微生物多樣性比野生型高；在PT與NT中，ACE、Chao1、Shannon、Simpson等指數差異很小 (甚至后者更大)，說明野生型小鼠對L.reuteriSL001添食更敏感。AD模型小鼠的腸道微生物多樣性比野生型豐富，添食L.reuteriSL001可以略微增加小鼠腸道菌群的多樣性，并且在野生型小鼠中的漲幅較大。

表1 小鼠腸道微生物豐度和多樣性指數Table 1 Intestinal microbial abundance and alphadiversity index in mice

2.2.2 Beta多樣性分析

由圖2可以看出，NT組和PT組表現出了較明顯的組內聚集，樣品根據所處組別相互聚集到一起，NC組和PC組并沒有依據其組別明顯聚集，添食組的組內微生物結構與組成的相似性高于未添食組，說明添食L.reuteriSL001可以在一定程度上減少組內個體間的差異。

圖2 PCoA聚類分析Fig.2 Cluster analysis by principal co-ordinates analysis.

由圖3可知，PC組和NC組 (圖3A) 之間，組內差異大于組間差異，但不顯著 (R=–0.052，P=0.538)。PT組與NT組 (圖3B) 之間，組間差異大于組內差異 (R=0.184，P=0.11)，表明添食L.reuteriSL001可以使同種小鼠的腸道微生物更趨于一致，保持更穩定的狀態。

圖3 小鼠腸道細菌群落的Anosim分析 (A：NC組與PC組間比較；B：NT組與PT組間比較)Fig.3 Anosim analysis of intestinal bacterial community in mice.(A) Comparison between NC group and PC group.(B)Comparison between NT group and PT group.

如圖4所示，4個處理組小鼠共聚為兩大分支，PC組和NC組之間的細菌群落結構相似性較高，共同聚集在上方，PT組和NT組之間的細菌群落結構相似性較高，共同聚集在下方，說明添食L.reuteriSL001可以造成不同基因型小鼠腸道微生物群落結構發生相似的改變。

圖4 小鼠腸道細菌群落聚集分析圖Fig.4 Clustering analysis of mice intestinal bacterial community.

2.3 樣品群落組成分析

2.3.1 物種維恩圖分析

由維恩圖 (圖5) 可知，4個處理組之間共有的OTU數目為667個，占絕大多數。NT組獨有OTU數目最多，為93個，PC組獨有的OTU數目最少，僅有28個，PT組和NC組獨有OTU數目分別為50個和54個，即AD模型小鼠初始腸道菌群豐富度小于野生型小鼠，而添食L.reuteriSL001能增加腸道菌群豐富度，野生型小鼠尤為顯著。另外，AD模型小鼠添食后，與野生型小鼠未添食組之間的共有OTU數目增加。這可以說明添食L.reuteriSL001能夠改變小鼠腸道微生物結構組成，增加獨有物種，豐富物種多樣性，也可以使AD模型小鼠的腸道微生物組成更接近于正常小鼠。

圖5 小鼠腸道微生物OTU程度的維恩圖Fig.5 Venn diagram of OTU degree of intestinal microorganisms in mice.

2.3.2 細菌門分類水平的比較

4組小鼠糞便微生物中的優勢菌群均為擬桿菌門 (Bacteroidetes) 和厚壁菌門 (Firmicutes)，這兩個菌門序列約占序列總數92% (圖6A)。AD模型小鼠中的擬桿菌門豐度低于野生型，厚壁菌門的豐度高于野生型，添食L.reuteriSL001會增加擬桿菌門所占比例，且PT組與PC組之間 (68.54%vs49.20%，P<0.05)、PT與NC之間 (68.54%vs54.38%，P<0.01) 存在顯著性差異。相反，添食L.reuteriSL001會降低厚壁菌門所占的比例，而且PT與PC之間 (24.15%vs42.80%，P<0.05)、PT與NC之間 (24.15%vs38.12%，P<0.05) 存在顯著性差異。為了更直觀地展現兩種菌門的占比差異，統計了厚壁菌門與擬桿菌門的比值 (圖6B)。其中PC組小鼠的F/B比值顯著高于NC組，添食L.reuteriSL001會降低比值且PT組比值最小，并且PT組分別與PC組、NC組之間有顯著性統計學差異。

2.3.3 細菌目分類水平的比較

從圖7可以看出，在目的水平上，擬桿菌目(Bacteroidales) 的相對豐度最大，并且AD模型小鼠的相對豐度低于野生型小鼠，添食L.reuteriSL001會增加其相對豐度，與圖6結果相一致。AD模型小鼠中的乳酸桿菌目 (Lactobacillales)、芽胞桿菌目 (Bacillales) 和雙歧桿菌目 (Bifidobacteriales)的相對豐度均低于野生型，添食L.reuteriSL001會增加這3個目在AD模型小鼠中的相對豐度，但在野生型中則是降低的效果。AD模型小鼠中的丹毒絲菌目 (Erysipelotrichales) 相對豐度高于野生型，添食L.reuteriSL001會降低其在兩種小鼠中的相對豐度。

圖6 門類群落結構組成分布圖 (A：門水平前10種細菌的相對豐度；B：Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) 在不同組中的比值情況.*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001 vs NC；#：P<0.05；##：P<0.01；###：P<0.001 vs PC)Fig.6 Distribution structure of community structure.(A) Relative abundance of the top 10 bacterial at the level of phylum.(B) The ratio of Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) in different groups (*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001 vs NC;#:P<0.05;##:P<0.01;###:P<0.001 vs PC).

圖7 目水平上前10種細菌的相對豐度Fig.7 Relative abundance of the top 10 bacterial at the level of order.

2.3.4 細菌屬分類水平的比較

從圖8可以看出，在屬水平上，4組小鼠的Allobaculum、毛螺旋菌屬 (Lachnospiraceae_NK4A136_group)、擬桿菌屬 (Bacteroides) 和乳酸菌屬 (Lactobacillu) 所占比例較大，相對豐度高。AD模型小鼠的擬桿菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 和擬普雷沃菌屬(Alloprevotella) 的相對豐度低于野生型小鼠，添食L.reuteriSL001會增加這些屬在AD模型小鼠中的豐度，降低在野生型小鼠中的豐度。AD模型小鼠的丁酸弧菌屬 (Butyrivibrio) 相對豐度也低于野生型，但是添食L.reuteriSL001后，其相對豐度在兩種小鼠中均出現降低。

圖8 含系統發育進化樹的熱圖(屬水平)Fig.8 Heatmap graph with phylogenetic tree (genus level).

2.4 腸道菌群LEfSe分析

通過對PC組和NC組進行LEfSe分析可知(圖9A–B)，野生型小鼠的優勢菌種為桿菌綱 (Bacilli)中的乳酸桿菌科 (Lactobacillaceae)，在AD模型小鼠中未發現優勢菌群。在PT組和NT組的比較中(圖9C)，均未發現豐度差異顯著的菌種，表明添食L.reuteriSL001可減小AD模型小鼠與野生型小鼠之間的差異。

圖9 LEfSe分析 (A：PC組與NC組組間LDA值分布柱狀圖；B：PC組與NC組組間進化樹分支圖；C：PT組與NT組組間進化樹分支圖)Fig.9 LEfSe analysis.(A) Histogram of LDA value distribution between PC group and NC group.(B)Phylogenetic tree branch diagram between PC group and NC group.(C) Phylogenetic tree branch diagram between PT group and NT group.

2.5 物種分類樹分析

由4個處理組不同比例的物種分類樹 (圖10)可以看出，野生型小鼠在桿菌綱 (Bacilli) 以及乳酸桿菌目、芽孢桿菌目、乳酸桿菌科中的比例占有絕對優勢，AD模型小鼠占有比例較小。添食L.reuteriSL001后，AD模型小鼠在以上菌群中的占有比例增加。

圖10 小鼠腸道微生物物種分類樹Fig.10 Species classification tree of intestinal microorganisms in mice.

3 討論

在本研究中，我們調查了AD模型小鼠(APP/PS1雙轉基因小鼠)和野生型小鼠 (C57BL/6)之間的腸道菌群差異，分析了L.reuteriSL001對兩種小鼠腸道微生物菌群結構的影響。α多樣性分析的結果表明，AD模型小鼠的α多樣性大于野生型小鼠，但是兩者之間的差異較小。添食L.reuteriSL001后，兩種小鼠的α多樣性均增加，并且AD模型小鼠的增幅較小。這可能是因為AD模型小鼠自身獨有的某些微生物，會對外來微生物的生長產生抑制作用，也可能是因為某些微生物的代謝產物改變了小鼠腸道環境，使部分微生物更加不易定殖繁殖，這也說明AD模型小鼠的腸道菌群不易調節，而這也成為一些治療手段的阻礙因素。β多樣性分析結果顯示，AD模型小鼠和野生型小鼠沒有出現明顯的組內聚集，組內差異大，但是添食L.reuteriSL001后均表現出較明顯的組內聚集，說明L.reuteriSL001可以在一定程度上減少組內個體間的差異，使同種小鼠的腸道微生物更趨于一致，保持更穩定的狀態。

在我們的測序數據中，所有樣品的優勢菌門都為擬桿菌門和厚壁菌門，兩種菌門約占序列總數92%。厚壁菌門和擬桿菌門與體重有著密切聯系[21]，而且厚壁菌門與擬桿菌門的比值 (F/B) 增加可能會導致過多的免疫反應和過量飲食，促進能量在體內的富集，造成肥胖[22-23]，所以F/B的比值也是肥胖和2型糖尿病 (T2DM) 的明顯標志[24]。有趣的是，阿爾茲海默癥被稱作為3型糖尿病[25]，并且其他研究也表明，相對于野生型，AD模型小鼠的F/B比值增加[12]。因此，F/B的比值增加可能指示著患AD風險也在增加[26]。由圖5B可以看出，AD模型小鼠中的擬桿菌門豐度低于野生型，厚壁菌門的豐度高于野生型，添食L.reuteriSL001會造成兩種小鼠的F/B比值下降，而且AD添食組與AD未填食組存在顯著性差異，表明L.reuteriSL001對AD模型小鼠有潛在的有益作用。

在目水平上，AD模型小鼠中的擬桿菌目、乳酸桿菌目、芽胞桿菌目和雙歧桿菌目的相對豐度均低于野生型，添食L.reuteriSL001可增加這4種目在AD模型小鼠中的相對豐度。擬桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌可以產生短鏈脂肪酸 (Short-chain fatty acid，SCFAs)，包括乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽。研究表明乙酸鹽可以增強全身葡萄糖穩態，也能穿過血腦屏障，向大腦發出飽足感[26]。丁酸鹽是一種多功能分子，可以保護神經，恢復血腦屏障的功能，具有明顯的認知和抗抑郁作用[27]。在AD模型中，丁酸鈉的使用可顯著改善小鼠的學習記憶能力[28-29]。丙酸鹽能影響小膠質細胞的活化并降低血腦屏障的滲透性，也可防止不適當的免疫反應[30-31]。綜上所述，SCFAs水平的降低可能與AD的發展密切相關。添食L.reuteriSL001可增加產生SCFAs的細菌，所以L.reuteriSL001可能對AD的發展具有緩解抑制作用。在AD患者的額葉、顳葉和頂葉皮質均發現GABA 水平降低，而腸道中的某些雙歧桿菌和乳桿菌可能將谷氨酸鹽轉化為GABA，調節機體的認知行為[17]。另外，服用某些乳酸桿菌和雙歧桿菌可以恢復AD模型小鼠腦海馬中神經營養因子的水平，抑制Aβ斑塊的產生并改善學習記憶能力[32-33]。芽胞桿菌具有產生乙酰膽堿的能力，而乙酰膽堿是AD患者大腦中減少的一種神經遞質，所以芽胞桿菌可能會通過迷走神經幫助膽堿信號的傳遞[34-36]。我們的研究表明，L.reuteriSL001可以增強以上細菌在AD模型小鼠中的相對豐度，這可能會降低腦部的免疫反應、Aβ斑塊的沉積和小膠質細胞的過度活化，進而改善學習記憶能力。L.reuteriSL001是否會通過以上途徑緩解AD病癥還需要進一步的實驗研究。

在屬水平上，AD模型小鼠的擬普雷沃菌屬和丁酸弧菌屬相對豐度均低于野生型小鼠，添食L.reuteriSL001會增加擬普雷沃菌屬在AD模型小鼠中的豐度，降低丁酸弧菌屬的豐度。擬普雷沃菌屬也可以產生短鏈脂肪酸，發揮對生物體有益的作用。丁酸弧菌屬可以產生內毒素，內毒素能夠引起炎癥反應、損害腸屏障、引起人體代謝與免疫失調，從而誘導肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病[37-38]。當機體衰老時，胃腸粘膜和血腦屏障的滲透性增加，內毒素更容易到達大腦，誘發神經炎癥和Aβ增加，進而引起AD疾病的發展[39-40]。有研究表明 AD 患者血漿中的內毒素含量遠遠高于正常人[41]，所以減少內毒素的產生可能會對AD的治療起到積極作用。添食L.reuteriSL001增加了對改善病癥有益的細菌，減少了加劇AD病理的細菌，表明L.reuteriSL001可以調節AD模型小鼠的腸道微生物結構，可能對生物體的生理功能產生積極影響。

通過LEfSe分析可知，野生型小鼠的優勢菌種為桿菌綱中的乳酸桿菌科和乳酸桿菌屬，在AD模型小鼠中未發現優勢菌群，這一結果也與物種分類樹結果相符。在添食L.reuteriSL001后，在兩種小鼠中均未發現豐度差異顯著的菌種，說明L.reuteriSL001干預可以改善AD模型小鼠的腸道微生物結構，使其更接近野生型小鼠。有其他研究報道AD模型小鼠腸道中豐度差異顯著的菌種為中紫單胞菌科的帕拉普氏菌 (Paraprevotellaceae)和普氏菌屬 (Prevotella)[42]，與我們本次實驗結果不一致，這有可能是因為選擇的AD模型小鼠以及鼠齡不同等多方面原因所導致。我們的結果可以豐富AD模型小鼠的腸道微生物研究，并具有一定的參考價值。若益生菌干預能夠重塑腸道平衡，減少患AD的風險，可為以后的AD治療提供一種安全可靠的策略。