重組枯草芽孢桿菌全細胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷

段培楓，尤甲甲，徐美娟，楊套偉，邵明龍，張顯，饒志明

江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2-O-α-D-甘油葡糖苷 (2-O-α-D-glu-copyranosylsn-glycerol) 是一種由一個葡糖基和一個甘油基通過糖苷鍵連接的糖苷類物質[1]，在自然界廣泛存在，特別是在耐鹽的藍細菌[2]和南非密羅木中，它是密羅木能在極端環境中生存和重新激活復生的最主要的活性物質[3]；另外，在日本清酒中也發現含有活性成分2-O-α-D-甘油葡糖苷[4]。2-O-α-D-甘油葡糖苷對生物體具有保護作用，當細胞處在高滲透壓、強紫外線或干旱等惡劣條件下時，它能在細胞表面形成保護膜，從而有效防止蛋白質分子變性、失活[5]，因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷可作為蛋白質和酶的穩定劑[6-7]。此外，由于其高保濕性、低吸水性的特點，2-O-α-D-甘油葡糖苷常被用作化妝品原料，以提高皮膚的保濕效果[8-9]；2-O-α-D-甘油葡糖苷還可以作為一種無致齲性的甜味劑添加到食品中[10]。因此，2-O-α-D-甘油葡糖苷在化妝品、食品、醫藥[11-12]、保健品[13]等領域發揮著重要作用，具有廣闊的應用和市場前景；但截至目前，德國的Bitop AG公司是唯一一家在工業規模上實現了2-O-α-D-甘油葡糖苷生產的公司[14]，而國內關于2-O-α-D-甘油葡糖苷的產業化仍處于起步、探索階段。

2-O-α-D-甘油葡糖苷具有多種合成方式，主要包括化學法合成、微生物合成和酶轉化合成[15]?；瘜W法合成的產物中由于存在多種同分異構體[4]，需多步純化，2-O-α-D-甘油葡糖苷產率較低，工藝復雜[10]，一般不在工業上采用。微生物合成法[2]是指利用經基因改造后的藍細菌等微生物在鹽脅迫條件下進行光合作用合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[16]，Martin等曾經報道了利用嗜根寡養單胞菌Stenotrophomonas rhizophilastrainDSM14405合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，但產量僅約為29 mg/L[17]。近些年一些學者通過分子改造和脅迫培養條件的優化[18]，提高了生物體內合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的產量，但據報道最高產量也僅約為0.3 g/L[19]，仍不具工業應用價值。酶轉化法包括α-葡糖苷酶轉化法和蔗糖磷酸化酶轉化法[15]。α-葡糖苷酶轉化法是以麥芽糖和甘油為底物，通過α-葡糖苷酶的轉糖基化，進行體外酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，轉化產物是包括2-O-α-D-甘油葡糖苷在內的3種不同立體異構體的混合物[10]，分離純化較為困難，生產成本高，不利于大規模生產；蔗糖磷酸化酶轉化法是奧地利學者Goedl等將蔗糖磷酸化酶基因在大腸桿菌中克隆表達，以蔗糖和甘油為底物，建立的一種酶促合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法[20]，這種方法具有底物原料低廉、產物簡單的優點，但也存在轉化時間長、體外條件下酶的穩定性差、容易失活等問題，同時大腸桿菌作為宿主菌的安全性問題[21-22]，這都限制了2-O-α-D-甘油葡糖苷在食品、藥品領域的工業化應用。

本研究首先將來源于腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides的蔗糖磷酸化酶基因(gtfA) 在大腸桿菌Escherichia coli中克隆表達，然后通過Ni-NTA親和柱對目標產物進行純化，收集SPase純酶并測定其酶學性質，再將gtfA基因導入食品安全級枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中，構建重組菌株B.subtilis168/pMA5-gtfA，通過優化培養條件，改善重組酶在胞內的表達水平，并將重組枯草芽孢桿菌作為全細胞催化劑以蔗糖和甘油為底物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，反應式如圖1所示。這也是首次將枯草芽孢桿菌全細胞催化的方法應用于2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成，同時通過全細胞轉化條件優化，獲得了較高的蔗糖轉化率和2-O-α-D-甘油葡糖苷產量，這為2-O-α-D-甘油葡糖苷的工業化生產提供了實驗基礎。

圖1 蔗糖磷酸化酶催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷[23]Fig.1 Synthesis of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol catalyzed by sucrose phosphorylase[23].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

高校教師是一流大學及學科專業建設的主體力量。對于行業特色型大學而言，“雙一流”建設使命的完成有賴于高素質的教師隊伍。在此背景下，科學有效地激發高校教師隊伍圍繞“雙一流”建設任務和目標要求，積極投身到“雙一流”建設大潮之中就顯得非常急迫而重要。高校教師績效考核評價體系是教師行為的“指揮棒”，科學設計能夠反映行業特色型大學“雙一流”建設任務的考核評價機制就成為實現“雙一流”建設目標的重要手段。［2］

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)及質粒pMA5、pET-28a均為本實驗室保藏。

1.1.2 酶和試劑

1.2.7 酶的最適pH的測定

BamHⅠ、XhoⅠ等限制性核酸內切酶與DNA聚合酶購于TaKaRa公司；小量質粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒購于南京諾維贊生物科技有限公司；2-O-α-D-甘油葡糖購于德國Bitop AG公司；蔗糖、甘油和果糖等分析純試劑均購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。

發酵培養基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，七水合硫酸鎂2 g/L，尿素3 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，硫酸鋅0.143 g/L，檸檬酸鈉5 g/L；pH 7.0–7.2。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

通過NCBI數據庫獲得編碼腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的基因序列，選擇合適的酶切位點，設計并合成兩對同源臂引物，序列參見表1。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 構建重組表達菌株

酶活測定體系為1 mL，其中蔗糖0.4 mol/L，甘油1 mol/L，MES緩沖液 (pH 7.0) 50 mmol/L，50 μg純酶，35 ℃下反應30 min，煮沸10 min終止反應。將反應液用0.2 μm濾膜過濾，稀釋后進行HPLC檢測。檢測條件為[20]：Agilent Hi-Plex Ca色譜柱，RID檢測器，超純水作流動相，柱溫85 ℃，流速 0.6 mL/min。酶活定義為：每1 min生成1 μmol 2-O-α-D-甘油葡糖苷所需的酶量為1個酶活單位 (U)。

這里還是“甜渣黨”們的天堂，一定得去一趟那些特色的wine shop，里面可謂是“臥虎藏龍”。同行的侍酒師孫昕就偶遇一間natural wine shop，里面竟然有著3000年前米西比亞時期的墓穴，不過更讓他興奮的是那豐富、獨特的自然酒和那頗有Geek范的老板。兩人興致勃勃地聊了好一會，小伙伴果斷花掉身上最后一個鋼，提著兩箱酒開開心心地走回酒店。

張自立回到五連至今，一直和母親住在一起。他和愛人申學群于2002年相識相愛，進而走進幸福的婚姻生活，兒子張睿健今年也9歲了，上小學三年級?，F如今，他們是三世同堂的幸福家庭。

挑重組菌E.coliBL21/pET-28a-gtfA于10 mL LB培養基中，37 ℃培養11–12 h后，以3% (V/V)的接種量轉接100 mL LB培養基，培養至OD600達0.8–1.0時，加入IPTG誘導后，25 ℃培養11–12 h，離心收集菌體，緩沖液懸浮后進行超聲破碎，將裂解液低溫離心，所得上清即重組菌粗酶液。將粗酶液用0.2 μm濾膜過濾處理，經Ni-NTA親和柱純化后收集SPase純酶，測定其酶學性質。

1.2.4 Spase在枯草芽孢桿菌中的表達

挑重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA于10 mL LB培養基中，37 ℃培養11–12 h后，以2% (V/V)的接種量轉接100 mL發酵培養基中，30 ℃培養20 h后離心收集菌體，超聲破碎后進行SDS-PAGE分析。

將酶反應體系分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的條件下測定酶活，確定酶反應的最適溫度，設置酶活最高組為100%對照。

就他本人研究初唐詩而言，章句家的詩、類書家的詩和“詩中的詩”，均有眼力判斷。他的《孟浩然》是從孫潤夫家藏的王維所畫的“孟浩然像”說起，《賈島》開篇勾勒賈島、姚合陰黯的形象，確乎源自性格的考量。定其品第，別其體性，估其價值，用歷史的眼光來研究，則已然是“綜合”下一階段的重心了。

以腸膜明串珠菌基因gtfA為模板，pET-28a-SP-F和pET-28a-SP-R為引物，PCR擴增，并用BamHⅠ和XhoⅠ酶切質粒pET-28a，膠回收酶切產物和PCR產物后用同源重組試劑盒進行連接，然后將連接產物轉化入E.coliBL21感受態細胞，涂布濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板過夜培養，挑取陽性轉化子，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，若測序正確，即重組菌株E.coliBL21/pET-28a-gtfA構建成功。以基因gtfA為模板，pMA5-SP-F和pMA5-SP-R為引物，PCR擴增，并用BamHⅠ和NheⅠ酶切質粒pMA5，將酶切產物與PCR產物經同源重組連接后轉化入E.coliBL21感受態細胞，涂布濃度為100 μg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板過夜培養，挑選測序正確的菌株，抽提質粒pMA5-gtfA，轉化到B.subtilis168感受態細胞中，涂布濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板過夜培養，挑取陽性轉化子，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，若測序正確，即重組菌株B.subtilis168/pMA5-gtfA構建 成功。

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1.2.6 酶的最適溫度的測定

1.2.5 酶活測定

1.2.3 Spase在大腸桿菌中的表達和純化

因此，高校在大學生生涯規劃指導中應緊密結合思想政治教育，變思政課程為課程思政，積極創新思政教育新模式，切合大學生的自主意識，充分調動學生的主動性、參與性，將教學重點與學生的興趣點有機結合起來，以學生喜聞樂見的方式呈現出來，讓學生易于接受。有的高校采用生動的展板方式，組織學生辯論賽，組織學生拍攝微電影，借助微信平臺創建特色欄目，如江南大學的寶哥說，內容詼諧幽默，深受學生喜愛。同時把思政教育層面擴展開來，學生并不是只在思政課上接受思想政治教育，全校的每一位教職工都應肩負起學生思想政治教育的責任與重擔，把思政教育貫穿于課堂、宿舍、實驗室等學校里的任何一個角落，與心理輔導、學生管理有機結合。

2.2 下載頻次 54篇高被引論文的總下載頻次為45 839次，單篇最高下載頻次為4 194次（對應的被引頻次為104次），單篇最低下載頻次為81次（對應的被引頻次為20次），平均下載頻次為849次∕篇。其中，下載頻次＞2 000次的論文有3篇，500次＜下載頻次≤2 000次的論文有26篇，100次＜下載頻次≤500次的論文有23篇，下載頻次≤100次的論文有2篇。

將酶反應體系分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下測定酶活，確定酶反應的最適pH，設置酶活最高組為100%對照。其中3種不同的緩沖體系：檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (pH 4.0–6.0)、MES緩沖液 (pH 6.0–8.0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH 8.0–10.0)。

1.2.8 酶的溫度穩定性的測定

“經過一段時間的實踐，‘聯合社’三方共贏的優勢逐步顯現?！表n素蘭說。農業企業通過規模采購向家庭農場供應農業生產資料，獲取差額利潤；通過直接與家庭農場聯結，建立穩定的生產基地，既確保了原料穩定供給，又減少了原料采購中間環節，節約了成本；通過指導監督家庭農場生產，保障了農產品質量安全。服務類農民專業合作社向家庭農場提供技術服務和作業服務，有了穩定的服務面積和集中連片的作業環境；產業類合作社在幫助企業統一組織生產資料供應及產品回收中獲得相應的提成。

取純酶分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的條件下保溫，定時取樣測定殘余酶活，設置初始酶活為100%對照。

為了后續利用構建的重組枯草芽孢桿菌作為全細胞催化劑來合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，通過優化菌株培養溫度和培養時間，改善SPase在宿主枯草芽孢桿菌的表達水平，以提高重組菌全細胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的能力。

2.1.1 心理護理 術前關注患者的心理狀態至關重要［7］?；颊邽槟贻p女性，病史2年余，因咳嗽、咳痰、發熱就診于多家醫院，口服抗結核藥物效果不滿意，經多次氣管鏡檢查發現氣管下段狹窄。隨著病情進展呼吸困難加重，霧化、平喘、對癥治療無效，使患者對治療信心不足。雖然對手術抱有希望，但又擔心手術失敗。護士及時了解患者心理變化，隨時了解各種檢查結果，給予心理疏導。告訴其醫護人員及家人正在積極想辦法、做準備，并列舉成功實施氣管手術的病例鼓勵患者，講解大致手術過程，增強患者戰勝疾病的信心。在不影響治療、護理的情況下，盡量讓家屬陪伴，增加患者安全感，使患者能積極配合檢查、治療。

1.2.9 酶的pH穩定性的測定

取純酶分別置于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中，保持2 h后，測定殘余酶活，以測得殘余酶活最高組為100%對照。

2 結果與分析

2.1 腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA的克隆與表達

從NCBI數據庫中檢索到腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的序列，長度為1 479 bp，合成該序列并作為模板，進行PCR擴增，電泳結果如圖2A所示，可見特異性條帶位置與目標基本一致。按照方法1.2.2構建重組菌株E.coliBL21/pET-28a-gtfA，細胞破碎后，SDS-PAGE分析結果見圖2B，重組菌裂解物上清在約56 kDa位置表達有明顯的蛋白質特征條帶，與報道中的分子量一致[24]，且經Ni-NTA親和柱純化后的重組蛋白在相應大小位置也有單一條帶，這表明基因gtfA在大腸桿菌中成功表達。

圖2 gtfA基因的克隆 (A)、表達及純化分析 (B)Fig.2 The result of gtfA gene cloning (A),expression and purification (B).(A) Lane M:DL 10 000 marker;lane 1–2:Gene gtfA.(B) lane M:protein marker;lane 1:E.coli BL21/pET-28a crude enzyme;lane 2:E.coli BL21/pET-28a-gtfA crude enzyme;lane 3:purified SPase.

2.2 溫度和pH對SPase酶活力和穩定性的影響

2.2.1 溫度對SPase酶活力和穩定性的影響

在不同溫度下測定SPase的酶活力，結果如圖3A所示，酶的最適反應溫度為35 ℃，在20–45 ℃之間時具有較高酶活力，當溫度超過45 ℃時，酶活力開始迅速下降。研究溫度對SPase穩定性的影響，結果見圖3B，可以看出，SPase在30 ℃、35 ℃保溫120 min后的殘余酶活力仍然高于80%，而在45 ℃保溫80 min后的殘余酶活力幾乎為零，這表明它在30–35 ℃范圍內有較好的穩定性。

圖3 SPase的最適溫度 (A) 和溫度穩定性 (B)Fig.3 Optimal temperature (A) and the temperature stability (B) of SPase.

2.2.2 pH對SPase酶活力和穩定性的影響

在不同pH下測定SPase的酶活力，結果見圖4A?？梢钥闯?，酶的最適反應pH為7.0，在pH處于6.0–8.0之間時具有較高酶活力。研究pH對SPase穩定性的影響，結果見圖4B，SPase在pH 6.0–7.0下保持2 h后的殘余酶活力仍在90%以上，表明其在此pH范圍內有較好的穩定性。

圖4 SPase的最適pH (A) 和pH穩定性 (B)Fig.4 Optimal pH (A) and the pH stability (B) of SPase.pH 3.0–6.0:citric acid-sodium citrate buffer;pH 6.0–8.0:MES buffer;pH 8.0–10.0:glycine-sodium hydroxide buffer.

2.3 SPase在枯草芽孢桿菌中的表達

枯草芽孢桿菌通常被認為是一種食品安全級菌種，因此我們選擇枯草芽孢桿菌作為宿主，用來開發2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全細胞生物催化方法。按照1.2.2中的方法構建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，加入溶菌酶后超聲破碎，SDS-PAGE分析結果如圖5所示，重組菌破壁上清在約56 kDa大小處表達有清晰的蛋白條帶，即表明SPase在宿主B.subtilis168中成功表達。

圖5 SPase在枯草芽孢桿菌中的表達Fig.5 Expression of SPase in B.subtilis.M:protein marker;lane 1:B.subtilis 168/pMA5 crude enzyme;lane 2:B.subtilis 168/pMA5-gtfA crude enzyme;lane 3:B.subtilis 168/pMA5-gtfA fermentation broth.

2.4 優化SPase在枯草芽孢桿菌中的表達

在頸椎減壓植骨融合術中，融合器在前期植骨愈合中起支撐作用，因此有必要對融合器的應力進行分析.圖6是融合器模型在各種運動下的等效應力分布.在前屈運動圖6（a）時，融合器的應力主要分布在上表面前方的鎖定孔的周圍以及下方區域，最大應力為123.1 MPa；后伸運動時，主要分布在上表面的前方鎖定孔的周圍及后方區域，但最大等效應力依然位于前方鎖定孔周圍，為115.5 MPa.側彎運動時，應力主要分布在融合器的側面和鎖定孔周圍，最大值為54.09 MPa.軸向旋轉運動時，應力分布比較均勻，不存在應力集中，最大值為45.03 MPa.

2.4.1 培養溫度的優化

本研究所用pMA5質粒搭載的是一種組成型的啟動子[25]，不需要其他因子的誘導，外源基因即可穩定表達，但其在宿主菌中表達水平的高低，會受環境因素的影響。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉接100 mL發酵培養基，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下培養16 h后，破碎細胞進行酶活力測定。結果顯示 (圖6A)，在30 ℃下培養時，測得菌體裂解物的酶活力最高，為1.31 U/mL；溫度低于30 ℃時，菌株的生長代謝速度過慢，表達量較低；而培養溫度高于35 ℃時，由于酶的熱穩定性不佳，在較高溫度下，酶活性會逐漸喪失，所以測得的酶活也較低。

2.4.2 培養時間的優化

生活中類似的人性之惡與無恥并不罕見。2011年下半年，因為所在大學接受教育部本科合格評估，我對學生的出勤抓得比較嚴，一有遲到、早退、曠課的行為都登記在冊，學生上課講小話什么的，也會遭到我的批評。沒想到期末教學檢查時，居然有學生利用匿名向老師書面提意見的機會將我說得一無是處，甚至還捏造了我在課堂上的“違規行為”。好在我所在的文學院主持正義，當年將我推薦為學校的優崗，并公之于眾，才將個別學生的這種無恥之舉壓下去。

按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉接100 mL發酵培養基后，30 ℃分別培養12、14、16、18、20、22、24 h后，破碎細胞進行酶活力測定。結果顯示 (圖6B)，培養20 h時菌體裂解物酶活力達到最高，為1.43 U/mL；繼續延長培養時間，酶活力并沒有提高，可能是因為在發酵后期，其他代謝副產物的大量積累，影響了目的酶的表達。

圖6 培養溫度 (A) 及培養時間 (B) 對枯草芽孢桿菌中SPase表達的影響Fig.6 Influence of culture temperature (A) and time (B) on SPase expression in Bacillus subtilis.

2.5 重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的條件優化

2.5.1 溫度對全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

溫度通過影響菌體狀態和酶促反應的效率而影響2-O-α-D-甘油葡糖苷的合成。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉接發酵培養基，30 ℃培養20 h后離心收集菌體，進行全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷?？刂瞥跏挤磻猵H 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油1 mol/L，菌體OD600為20，反應溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的條件下進行全細胞轉化反應。結果如圖7A所示，全細胞轉化反應溫度為30 ℃時，蔗糖轉化率最高，達到53.2%，2-O-α-D-甘油葡糖苷產量為134.8 g/L；在45 ℃時，蔗糖轉化率較低，僅為28.4%。

2.5.2 初始pH對全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉接發酵培養基，30 ℃培養20 h后離心收集菌體，進行全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，理論上轉化反應過程中pH無明顯變化，探究初始pH對全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響?？刂品磻獪囟葹?0 ℃，蔗糖濃度1 mol/L，甘油濃度1 mol/L，菌體OD600為20，初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的條件下進行全細胞轉化反應。結果如圖7B所示，在pH小于7.0時，蔗糖轉化率隨pH的升高而增加，在pH 6.5–7.5時，產率較高，其中，pH 7.0時最高為53.5%。

2.5.3 菌體量對全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

車輛工程作為機械行業的一個代表產業和學科，汽車的設計、生產和發展也代表了機械行業的科技能力和一個國家制造水平。汽車行業作為一個較為成熟的領域，其中的制造技術和管理技術也對其他行業有著十分重要的借鑒性和啟示性，因此了解汽車方面的專業詞匯有很強的實用意義。

在轉化反應中將菌體濃度控制在適宜的水平，對滿足生產需要和降低生產成本是至關重要的。按方法1.2.4接種重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，轉接發酵培養基，30 ℃培養20 h后離心收集菌體，進行全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷?？刂品磻獪囟葹?0 ℃，初始pH 7.0，蔗糖濃度1 mol/L，甘油濃度1 mol/L，菌體OD600分別為10、20、30、40、50、60、70、80的條件下進行全細胞轉化反應。結果如圖7C所示，轉化體系菌體OD600為40時，蔗糖轉化率最高，達到61.7%，2-O-α-D-甘油葡糖苷產量為156.5 g/L；菌體量繼續增加，轉化率并沒有隨之提高，可能是因為轉化體系中，小部分的蔗糖被菌體自身用于維持基本的生命活動所消耗。

圖7 溫度 (A)、pH (B)、菌體密度 (C) 及底物濃度 (D) 對重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響Fig.7 Influence of temperature (A),pH (B),cell density (C) and substrate concentration (D) on the transformation of 2-O-α-D-glu-copyranosyl-sn-glycerol in recombinant B.subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells.

2.5.4 底物濃度對全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的影響

當反應體系中沒有磷酸鹽的情況下，蔗糖磷酸化酶催化蔗糖分解為果糖和葡糖基-酶中間體，并以甘油為受體催化轉糖基反應合成2-O-α-D-甘油葡糖苷。理論上，蔗糖和甘油合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的摩爾比為1︰1，但以甘油為受體的轉糖基反應是一個可逆反應，反應中使甘油過量，可能會促使蔗糖得到較高的轉化率。所以，控制反應溫度30 ℃，初始pH 7.0，菌體OD600為40，蔗糖濃度1 mol/L，設置不同濃度蔗糖和甘油的摩爾配比的條件下進行全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，結果如圖7D所示，轉化體系中的蔗糖和甘油的摩爾配比為1︰2.5時，蔗糖轉化率達76.3%，繼續增大甘油濃度，轉化率并沒有隨之提高。

2.6 5 L發酵罐全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷

為驗證重組菌B.subtilis168/pMA5-gtfA在大體系中的轉化水平，在實驗室5 L發酵罐進行初步測試。用1 L 50 mmol/L的MES緩沖液懸浮B.subtilis168/pMA5-gtfA菌體，控制反應溫度30 ℃，初始pH 7.0，蔗糖1 mol/L，甘油2.5 mol/L，菌體OD600為40的條件下于5 L發酵罐上進行轉化，HPLC分析檢測轉化液中各組分含量。結果如圖8所示，前期的轉化速率較快，在24 h后反應逐漸減慢，至48 h轉化率基本達到最大，共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均轉化速率為15.6 mmol/(L·h)，蔗糖轉化率約為75.1%?？梢园l現，反應后期繼續延長轉化時間，轉化率變化不明顯，出現這種情況的原因，一方面可能是由于反應趨于平衡，另一方面可能是因為轉化時間較長，酶活力逐漸喪失。

春節前后，人們都會參加大小的餐飲聚會，不定時定量的飲食往往會引起身體代謝系統的紊亂，而使體內毒素堆積。其中，肝、腎是人體內最重要的兩個排毒器官。那么，我們該如何為自己的身體排毒呢？下面就推薦幾種天然排除人體毒素的食物，供大家選購。

圖8 重組菌B.subtilis 168/pMA5-gtfA在5 L發酵罐全細胞轉化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷Fig.8 The recombinant B.subtilis 168/pMA5-gtfA whole cells catalyze the synthesis of 2-O-α-D-glucopyranosyl-sn-glycerol in 5 L fermenter.

3 討論

本研究將腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因gtfA在大腸桿菌中進行克隆表達，研究其酶學性質，再將gtfA基因導入食品安全級枯草芽孢桿菌，用來開發2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的全細胞生物催化方法。成功構建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis168/pMA5-gtfA，通過優化培養條件，實現了蔗糖磷酸化酶在重組枯草芽孢桿菌胞內的高效表達，并將重組菌用作全細胞生物催化劑合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，利用優化后的全細胞轉化條件，在30 ℃、pH 7.0、菌體OD600為40、底物蔗糖濃度1 mol/L、甘油濃度2.5 mol/L的條件下，在5 L發酵罐進行全細胞轉化48 h后，生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L，平均轉化速率為15.6 mmol/(L·h)，蔗糖轉化率約為75.1%，這是目前報道的利用重組枯草芽孢桿菌催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的最高產量。2-O-α-D-甘油葡糖苷是一種在食品、化妝品、保健品及醫藥領域有著重大應用前景的高附加值產品，本研究首次利用枯草芽孢桿菌全細胞轉化的方法應用于合成2-O-α-D-甘油葡糖苷，與酶法合成相比，全細胞催化發生在胞內，反應更穩定，可重復利用率高，而且省去了酶法催化前期所需破碎細胞的過程，工藝流程更簡便，經濟效益更高；另外，將食品安全級菌株用作表達宿主，也拓寬了產品在食品、醫藥領域的應用。然而，在合成2-O-α-D-甘油葡糖苷上，不管是酶法合成，還是全細胞催化方法，最終轉化液中都有一定濃度的蔗糖和果糖存在，雖然有研究報道過一種從轉化液中分離純化出2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法，但也僅有63%的產品收率[20]。所以，仍需要通過改進下游分離純化工藝[26]，以進一步提高2-O-α-D-甘油葡糖苷收率?？傊?，本研究所構建的重組枯草芽孢桿菌全細胞催化方法及其相關研究結果，為2-O-α-D-甘油葡糖苷的工業化生產及應用奠定了理論和實驗基礎。