黃芪甲苷對腎癌細胞系（769-P）增殖、凋亡的影響

施志超

腎癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，起源于腎小管上皮細胞，約占腎臟腫瘤的90%，其發病率僅次于膀胱癌，為泌尿系腫瘤發病率中的第二位，在過去的幾十年中，其發病率逐年上升，在所有成人惡性腫瘤中占5%左右[1]。腎癌的治療過程中存在對放化療不敏感、術后預后差等問題。隨著中藥學的發展，眾多中藥被應用于腫瘤的治療[2]，相比傳統的化療藥物，中藥具有多靶點、藥物毒副作用小等優勢[3]。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ）是從黃芪提取的物質之一，也是眾多單體中活性較強的成分之一[4]。研究表明，黃芪有抗肝癌細胞等作用[5]。本研究通過檢測黃芪甲苷對769-P 細胞的細胞活性、活性氧（ROS）、線粒體膜電位和胱天蛋白酶3/9（Caspase 3/9）活性的影響，旨在研究黃芪甲苷抗腎癌的活性及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人源腎癌細胞（769-P）（上海中科院細胞庫）。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養基（Gibco公司，8120481）；胎牛血清（Gibco 公司，42G5093K）；ROS 檢測試劑盒（碧云天生物科技公司，100620201106）；線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物科技公司，032421210013）；CCK-8 試劑盒（碧云天生物科技公司，010919190109）；啶磷脂酰絲氨酸蛋白抗體偶聯熒光標記物FITC（Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物科技公司，062719190909）；Caspase 3 活性檢測試劑盒（碧云天生物科技公司，071018190112）；Caspase 9 活性檢測試劑盒（碧云天生物科技公司，060618200410）；黃芪甲苷（純度≥98%，阿拉丁生化科技公司，2007264）。CO2培養箱（日本PHCbi 公司），流式細胞儀（美國BD 公司），酶標儀（瑞士Tecan 公司），高速低溫離心機（美國Thermo 公司）。

1.3 方 法

1.3.1 人源腎癌細胞（769-P）在標準細胞培養條件（37 ℃，5% CO2）下，RPMI 1640 培養基添加10%胎牛血清，1% GlutaMAX 和100 μ/mL 青霉素-鏈霉素。用含有EDTA 的胰酶消化，按1∶4 傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 使用CCK-8 檢測細胞的增殖能力。769-P 細胞接種到96 孔板，貼壁生長24 h，使用0、5、10、20、40 和80 μM 的黃芪甲苷溶液共同孵育48 h 后，每孔加入10μL CCK-8 試劑，培養箱內孵育1 h 后進行檢測，使用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度。以0 μM 黃芪甲苷溶液組作為對照組，計算各組769-P 細胞活性。

1.3.3 細胞ROS 水平檢測 流式細胞儀檢測細胞ROS 水平。取對數生長期細胞置于6 孔板中（3×105個/孔）用于實驗，待細胞貼壁生長24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔加入1 mL DCFH-DA（1∶1000 稀釋）探針進行染色，放入培養箱孵育20 min，使用PBS 洗去探針染色，使用流式細胞儀檢測探針熒光強度（ROS 水平）。

1.3.4 細胞線粒體膜電位水平檢測 流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位水平。取對數生長期細胞置于6孔板中（3×105個/孔）用于實驗，待細胞貼壁生長24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔使用1 mL JC-1 探針染色液體進行染色，放入培養孵育20min 后，使用染色緩沖液（1×）清洗2 次，使用流式細胞儀分別檢測線粒體膜電位水平。

1.3.5 誘導細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。取對數生長期細胞置于6 孔板中（3×105個/孔）用于實驗，待細胞貼壁生長24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育48h。每孔使用5 μL Annexin V FITC 和10 μL PI 雙染法染色，避光反應20 min，PBS 洗滌2 次后，流式細胞儀檢測細胞凋亡比例變化。

1.3.6 Caspase 3 和Caspase 9 活性檢測 采用分光光度法檢測Caspase 3 和Caspase 9 活性。取對數生長期細胞置于6 孔板中（1×106個/孔），待細胞貼壁生長24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0，10，20 和40 μM）共同孵育48 h，收齊細胞，4 ℃離心10 min 后去除上清液，每管細胞加入100 μL 裂解液冰上裂解15 min 后，取裂解液50 μL 和檢測緩沖液40 μL、檢測試劑10 μL 在37 ℃孵育60 min，使用酶標儀在405 nm處的吸光度值，計算Caspase 3 和Caspase 9 活性。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件。所有正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較作Dunnett’s檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對769-P 細胞增殖活性的影響 使用CCK-8 檢測黃芪甲苷對769-P 細胞增殖活性的影響。結果表明，與空白對照組比較，在5～80 μM 濃度范圍內，經黃芪甲苷處理48 h 后，以濃度依賴性的方式抑制769-P 細胞增殖活性，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞生長影響（%，）

表1 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞生長影響（%，）

注：與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.2 黃芪甲苷對ROS 水平的影響 使用DCFH-DA探針檢測黃芪甲苷促進769-P 細胞產生的ROS。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細胞24h 后，與對照組比較，熒光強度明顯上升，結果表明，黃芪甲苷以劑量依賴性方式增加ROS 產生，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞ROS 水平影響（熒光強度，）

表2 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞ROS 水平影響（熒光強度，）

注：ROS 為活性氧；FL1-A 為JC-1 單體；與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.3 黃芪甲苷對線粒體膜電位的影響 使用JC-1探針檢測黃芪甲苷對769-P 細胞線粒體膜電位的影響。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細胞24 h后，與對照組比較，黃芪甲苷處理組的綠色熒光（JC-1 單體）與紅色熒光（JC-1 聚合物）的比值升高，黃芪甲苷處理后，769-P 細胞的線粒體膜電位下降，黃芪甲苷能以劑量依賴的方式降低769-P 細胞線粒體膜電位，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3、圖2。

表3 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞線粒體膜電位的影響（熒光強度比值（）

表3 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞線粒體膜電位的影響（熒光強度比值（）

注：FL1-A 為JC-1 單體；FL2-A 為JC-2 單體；與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.4 黃芪甲苷對線粒體膜電位的影響 Annexin V FITC/PI 雙染法檢測黃芪甲苷對769-P 細胞凋亡的影響。不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細胞48 h后，Annexin V FITC/PI 雙染法檢測結果顯示（Q1 代表壞死細胞，Q2 代表晚期細胞，Q3 代表早期凋亡細胞，Q4 代表正常細胞），與對照組比較，黃芪甲苷處理組凋亡比例明顯增加（Q2+Q3），表明黃芪甲苷能誘導769-P 細胞凋亡，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞凋亡率的影響（%，）

表4 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞凋亡率的影響（%，）

注：與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05

2.5 黃芪甲苷對Caspase 3/9 活性的影響 使用酶標儀檢測黃芪甲苷對769-P 細胞Caspase 3/9 活性的影響。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細胞48 h 后，結果表明，黃芪甲苷能以劑量依賴的方式促進Caspase 3/9 活性升高，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表5。

表5 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞Caspase 3和Caspase 9 的影響（相對活性，）

表5 不同濃度黃芪甲苷對769-P 細胞Caspase 3和Caspase 9 的影響（相對活性，）

注：Caspase 3 為胱天蛋白酶3；Caspase 9 為胱天蛋白酶9；與0 μM黃芪甲苷比較，aP<0.05，bP<0.01

3 討論

目前治療腎癌以手術治療和化療為主[6]，但是傳統的化療已經不能滿足臨床治療的需求，因此探尋新的治療腎癌的藥物成為新的熱點之一。過量產生ROS，導致氧化應激是眾多抗腫瘤藥物的機制之一[7]。ROS 不僅直接攻擊脂質、蛋白質和DNA，導致線粒體膜電位的下降，并充當誘導細胞凋亡的信號通路的上游信號分子之一[8]。

本研究結果表明，與空白對照組（0 μM 黃芪甲苷）比較，黃芪甲苷處理組能顯著地以濃度依賴性的方式抑制769-P 的增殖活性，降低細胞的存活率，具有抗腫瘤活性。在腫瘤細胞死亡的方式中，凋亡是其中主要的死亡方式之一[9]，同時細胞凋亡是細胞毒性中一個非常重要的現象。細胞凋亡是一個高度調控的過程，而在化療過程中產生的腫瘤凋亡通常是由于化療藥物使用誘導細胞凋亡的產生[10]。它是由兩個主要的細胞死亡信號通路觸發，死亡受體介導（外源性）和線粒體（內源性）信號通路[11]。線粒體膜電位的下降，導致細胞色素c 從線粒體釋放到細胞質中，隨后激活Caspase 9[12]。Caspase 9 的激活導致Caspase 3 的激活，切割特定底物以執行凋亡。本研究表明，與0 μM 黃芪甲苷組比較，10、20 和40 μM 黃芪甲苷處理組的熒光明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05 或P<0.01），說明黃芪甲苷能促進769-P 細胞內ROS 的水平升高，細胞內的ROS 異常升高，會促進細胞凋亡的發生。本研究采用JC-1 探針檢測線粒體膜電位的情況，發現黃芪甲苷能顯著降低769-P 的線粒體膜電位，這也進一步說明黃芪甲苷導致的ROS 升高進一步影響到線粒體的膜電位，誘導細胞凋亡[13]。本研究通過Annexin V FITC/PI 雙染對黃芪甲苷誘導細胞凋亡進行研究，發現黃芪甲苷10、20 和40 μM處理組的早期凋亡和晚期凋亡比例呈現濃度依賴性增加，而壞死區域的細胞比例無明顯變化，進一步說黃芪甲苷誘導769-P 細胞死亡的主要方式是凋亡而并非壞死。在黃芪甲苷處理組Caspase 3/9 相對活性呈現濃度依賴性增加，表明黃芪甲苷能顯著提高Caspase 3/9 的活性，Caspase 3/9 作為線粒體凋亡途徑中的標志性蛋白，參與到細胞凋亡過程中，表明黃芪甲苷誘導細胞凋亡的分子機制可能與激活Caspase 通路有關。作為傳統中藥植物黃芪的主要活性成分，黃芪甲苷在本研究中具有顯著的體外抗腎癌細胞系769-P 的活性，其原因可能是與促進細胞內ROS 的產生，降低膜電位導致線粒體損傷有關。

總之，黃芪甲苷可抑制腎癌細胞系769-P 的增殖活性，促進ROS 水平升高，降低線粒體膜電位，誘導細胞凋亡，其分子機制可能與激活Caspase 通路有關。