MiR-767和CYLD在皮膚惡性黑色素瘤中的表達和意義

張馨月 高西 許飏

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮膚科常見的一種起源于外胚層神經嵴皮膚黑色素細胞的惡性腫瘤，易發生轉移，復發率和病死率較高，預后較差[1]。CMM在不同國家、地區及人種中的發病率有較大差異，其與惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)家族史、紫外線照射、創傷等具有較大關系。有報道顯示，CMM發病率占皮膚惡性腫瘤的5%左右，但占MM的90%，在皮膚惡性腫瘤中病死率最高，其病死率和發病率每年呈上升趨勢，且對傳統的化療、放療等治療手段不敏感，因此，尋找CMM治療新靶點成為現代醫學研究的熱點及難度[2,3]。微小RNA(microRNA，MiRNA)是當今分子生物醫學研究的熱點，與多種疾病的發生發展有關，但關于MiR-767在CMM的研究還較少，圓柱瘤基因(CYLD)是一種抑癌基因，具有去泛素化酶作用，在腫瘤疾病中能夠通過對核因子-κB(NF-κB)、JNK等信號通道參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程[4,5]。因此，本研究旨在探討MiR-767和CYLD在CMM中的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月至2013年10月重慶醫科大學附屬大學城醫院和西南醫科大學附屬醫院病理確診的CMM患者45例，采集患者腫瘤組織及其配對的瘤旁正常組織進行研究。其中男28例，女17例；年齡32～68歲，平均年齡(51.37±5.53)歲；按照AJCC中CMM TNM分期標準：Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例；有淋巴結轉移15例，無淋巴結轉移30例。本研究經重慶醫科大學附屬大學城醫院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經組織病理學確診為CMM；②患者年齡≥18歲；③患者對本研究知情，自愿參與并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①入組前有手術、放化療、免疫治療史者；②合并糖尿病、高血壓等嚴重慢性疾病者；③合并其他惡性腫瘤者；④多方面確診預測生存期<3個月者；⑤妊娠期或哺乳期患者；⑥合并血液性疾病及免疫抑制性疾病者。

1.3 樣本收集 收集患者術后切除的腫瘤組織及對應的瘤旁正常組織，無菌0.9%氯化鈉溶液清漂洗殘留血跡，液氮保存，再轉入-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 試劑與儀器 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自晶美生物工程有限公司，反轉錄試劑盒、Ultra SYBR Mixture購自北京康為生物科技有限公司，MyCycler PCR儀購自美國BIORAD公司，實時熒光定量RT-PCR(Light Cycler)購自美國羅氏公司，紫外凝膠成像分析系統購自美國GENE公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.5 檢測方法

1.5.1 總RNA提?。喝〗M織樣本加液氮研磨至粉末置于離心管中，加入Trizol (每50～100毫克樣本加Trizol 100 ml)，提取RNA，實驗步驟按照試劑盒說明書執行，采用紫外分光光度計檢測濃度及純度，RNA純度高，無降解、無DNA污染方可用于cDNA合成。

1.5.2 逆轉錄合成:冰上配制，反應體系為：10×g DNA Eraser Buffer 1 μl，gDNA Eraser 0.5 μl，RNA 模板 1.5 μl，RNase -free ddH2O 8 μl，漩渦混合器混勻，放入金屬浴中65℃預熱5 min，短暫離心，冰上冷卻加入：HiFiScript 10 μl，Prime Mix 1 μl，5×ScriptRT Buffer 4 μl，RNase RNase -free ddH2O 4 μl，PCR反應條件：42℃，40 min；85℃，5 min；引物-20℃保持備用。

1.5.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測:以U6、GAPDH做內參基因，以逆轉錄合成cDNA為模板，反應體系：2×Ultra SYBR Mixture 7.5 μl，cDNA 1 μl，Forward Priner 0.31 μl，Reverse Priner 0.3 μl，RNase -free ddH2O 5.9 μl，反應總體積15 μl，做3個重復，反應條件：95℃預變性,10 min；95℃變形，15 s；60℃退火，1 min；50個循環，72℃，30 s。進行PCR擴增，采用2-CT方法計算 MiR-767和CYLD的相對定量。見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

2 結果

2.1 MiR-767和CYLD表達水平比較 腫瘤組織中MiR-767表達水平明顯高于瘤旁正常組織(P<0.05)，CYLD表達水平顯著低于瘤旁正常組織(P<0.05)。見表2。

2.2 CMM中MiR-767和CYLD表達與臨床病理特征之間關系 以CMM中MiR-767和CYLD表達的中位數(3.28,0.41)為界值將CMM患者分成MiR-767高表達組(n=24)、低表達組(n=21)，CYLD高表達組(n=18)、低表達組(n=27)。MiR-767表達與性別差異無統計學意義(P>0.05)，與腫瘤分期、淋巴結轉移、腫瘤厚度密切相關(P<0.05)，CYLD表達與性別、腫瘤分期差異無統計學意義(P>0.05)，與淋巴結轉移、腫瘤厚度密切相關(P<0.05)。見表3。

組別MiR-767CYLD瘤旁正常組織0.86±0.280.73±0.22腫瘤組織 5.37±0.520.11±0.06t值51.22618.239P值<0.001<0.001

表3 CMM中MiR-767和CYLD表達與臨床病理特征之間關系 例

2.3 MiR-767與CYLD表達相關性 隨著CMM腫瘤組織中MiR-767表達水平升高，CYLD表達呈明顯降低趨勢，MiR-767與CYLD表達呈負相關(r=0.791，P<0.001)。見圖1。

圖1 MiR-767與CYLD表達相關性

2.4 CMM Kaplan-Meier生存分析 MiR-767高表達組預后5年存活率為12.50%，MiR-767低表達組預后5年存活率為33.33%，MiR-767高表達組存活率顯著低于低表達組存活率，2組比較差異有統計學意義(χ2=4.690，P=0.030)。CYLD高表達組預后5年存活率為38.89%，CYLD低表達組預后5年存活率為14.81%，CYLD高表達組存活率顯著高于低表達組存活率，2組比較差異有統計學意義(χ2=4.072，P=0.044)。見圖2、3。

圖2 MiR-767高表達組與低表達組生存曲線比較

圖3 CYLD高表達組與低表達組生存曲線比較

2.5 CMM預后的多因素回歸分析 經COX多因素分析顯示，性別對CMM患者預后無明顯影響(P>0.05)；腫瘤分級、淋巴結轉移、腫瘤厚度、MiR-767是影響CMM患者預后的危險因素(P<0.05)，CYLD是影響CMM患者預后的保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響CMM預后的多因素回歸分析

3 討論

隨著人們生活習慣、環境等的改變，CMM已成為中國發病率增殖最快的惡性腫瘤之一，對同時也是侵襲性最快的皮膚惡性腫瘤，對機體任何器官幾乎都能夠進行侵襲[6]。CMM的多發部位為頭面部、背部、四肢及肢端等部位，CMM早期主要癥狀為黑色素痣快速變大、邊緣界限不明顯、顏色不均勻、瘙癢等，早期易被當做黑色素痣不被重視，早期發現經手術及放化療治愈率可達90%～95%，但一旦發展到晚期出現淋巴結轉移、衛星灶等治愈率較低，有調查顯示中國CMM患者5年生存率低于20%[7,8]。因此，尋求CMM治療的新靶點成為提高CMM患者生存率的關鍵。

miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，研究發現1%～3%的miRNA基因組可對人類高達30%的基因進行調控，已成為現代生物學研究的熱點。miRNA主要通過對信使RNA(mRNA)翻譯干擾來調控下游相關靶基因表達，已有研究證實miRNA與早期胚胎發育、細胞增殖和分化、腫瘤細胞侵襲與轉移、細胞凋亡、血管生成、炎癥過程等都有密切聯系[9,10]。Yang等[11]研究發現，miR-124能夠通過抑制多功能蛋白聚糖抑制黑色素瘤細胞增殖、侵襲及遷移。陳瑤等[12-14]研究顯示，miR-25在MM患者腫瘤組織中表達上調，并通過調控下游靶基因促進黑色素細胞增殖及侵襲。本研究結果顯示，CMM腫瘤組織中MiR-767表達水平明顯高于瘤旁組織，CYLD表達水平顯著低于瘤旁組織這與Zhang等[15]研究基本相一致，表明CMM患者腫瘤組織中MiR-767表達上調，CYLD表達下調。經病理特征之間的關系比較發現，MiR-767表達與性別無明顯關系，與腫瘤分期、淋巴結轉移、腫瘤厚度關系密切，CYLD表達與性別、腫瘤分期無明顯關系，與淋巴結轉移、腫瘤厚度密切相關。說明MiR-767與CYLD可能參與CMM腫瘤細胞增殖、遷移的過程，同時有可能成為CMM治療的新靶點。通過Pearson相關性分析顯示，隨著CMM腫瘤組織中MiR-767表達水平升高，CYLD表達呈明顯降低趨勢，MiR-767與CYLD表達呈負相關。說明在CMM患者體內MiR-767高表達能夠抑制CYLD基因表達，引起患者發病。CYLD是新發現的一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤細胞中低表達，CYLD去泛素化活性能夠對NF-κB、WNT/β-catenin、JNK等信號通路發揮負向調控作用，在調控細胞周期、細胞凋亡、炎性反應及腫瘤發生等發揮重要作用[16]。倪芳等[17]研究發現CYLD，在肝癌細胞中低表達，低表達的CYLD激活了NF-κB信號通路，肝癌細胞明顯增殖。Hayashi等[18]研究表明，在乳腺癌細胞中CYLD顯著降低，并且通過下調CYLD表達能夠活化NF-κB信號途徑來促進乳腺癌細胞轉移。在CMM腫瘤細胞中，MiR-767可能是通過其表達上調抑制CYLD表達，而CYLD蛋白上存在能使κB去泛素化的結合位點，CYLD表達降低使κB去泛素化減少，而κB是NF-κB信號途徑中關鍵抑制蛋白，因此，NF-κB信號途徑被激活，引起CMM腫瘤細胞增殖及遷移。生存曲線分析顯示，MiR-767高表達患者5年生存率低于低表達患者，CYLD高表達患者5年生存率高于低表達患者，說明可通過對MiR-767與CYLD表達水平檢測判定CMM患者預后情況。經COX多因素分析顯示，性別對CMM患者預后無明顯影響；腫瘤分期、淋巴結轉移、腫瘤厚度、MiR-767是影響CMM患者預后的危險因素，CYLD是影響CMM患者預后的保護因素，提示可通過對MiR-767與CYLD靶向治療延長CMM患者預后生存時間。

綜上所述，本研究通過對CMM腫瘤組織中MiR-767和CYLD水平檢測顯示，CMM患者腫瘤組織中MiR-767表達上調，CYLD表達下調，與腫瘤侵襲、轉移關系密切，MiR-767與CYLD表達呈負相關，為CMM患者靶向治療提供新思路，同時可作為CMM預后潛在的檢測指標。