JDP2、Phf2 蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及其與病理特征的相關性

彭鳳翔 李 丹 高蓉梅 李永春 葉小娟

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）發病率和病死率均呈逐年上升趨勢，一旦發展為晚期NSCLC，其侵襲及轉移進展無法遏制且對常規化療藥物耐受性和敏感性較低，導致治療困難［1］。研究表明，二聚化蛋白（Jun dimerization protein 2，JDP2）信號通路與腫瘤細胞增殖、分化、遷移有關，提示干擾或加強該通路可有效抑制腫瘤細胞生長［2］。惡性腫瘤疾病侵襲與轉移抑癌基因、癌基因及其基因產物的調控與Phf2 蛋白過度表達有關，Phf2 蛋白在食管癌、乳腺癌及NSCLC 中均有不同表達［3-5］。本文檢測NSCLC 癌組織中JDP2、Phf2 蛋白表達，采用2×2配對資料關聯性分析兩者關聯性JDP2、Phf2 蛋白一致性，并分析其與臨床病理特征相關性，以期為NSCLC 治療和預后判斷提供新的策略方案。

材料與方法

一、臨床資料

經本院醫學倫理會討論并通過和患者簽署知情同意書后，收集2018 年1 月至2019 年3 月我院切除并經病理證實的65 例NSCLC 標本，其中＞腫瘤邊緣5 cm 的癌旁組織作為空白對照組。入選標準：①術后經病理學檢查確診為NSCLC；②年齡20 ～85歲；③入院前未接受任何抗癌治療；④臨床資料及隨訪資料完整；⑤既往無NSCLC 病史；⑥未合并嚴重創傷。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②依從性不好，不能定期隨訪；③合并腦血管、肝腎和造血系統等嚴重危及生命的原發性疾病者；④標本采集困難或標本不正確；⑤術前合并全身炎癥反應或泌尿系統感染；⑥合并嚴重精神病或溝通障礙。 男性39 例，女性26 例；中位年齡60 歲，平均（62.32±9.30）歲，＞60 歲41 例，≤60 歲24 例；平均身體質量指數（body mass index，BMI）16.42 ～21.15 kg／m2，中位BMI 21.32 kg／m2，≤21.32 37 例，＞21.32 28 例；腫瘤直徑≤3 cm 33 例，＞3 cm 32 例；分化程度：低級26 例，中級21 例，高級18 例；有腫瘤轉移33 例，無腫瘤轉移32 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期19 例、Ⅲ期24 例；病理類型：腺癌27 例，鱗癌38 例。

二、研究方法

①基線資料，包括性別、年齡、BMI、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤轉移、腫瘤分期、病理類型；②取10%甲醛溶液固定好的癌組織，修剪，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，切成5 μm 連續切片；二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，流水沖洗；1%鹽酸溶液分化數秒，流水沖洗，伊紅染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE 染色結果，明確NSCLC 病理學特點；③JDP2、Phf2 蛋白表達水平：采用RM2235 組織切片機將所有包蠟組織切成4 μm 連續切片，依次采用二甲苯、檸檬酸鈉緩沖液及3%過氧化氫溶液進行脫蠟、抗原修復、梯度酒精水化、PBS 緩沖液漂洗、內源性過氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PAX-2、Galectin-1 多克隆抗體（濃度1∶100，購自Santa Cruz公司）4 ℃孵育過夜；PBS 漂洗，滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min；PBS 漂洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS 漂洗，經DAB 顯色試劑盒（Solarlaio）顯色、蘇木精復染、梯度酒精脫水，透明，中性樹脂封片，DMM-440 倒置顯微鏡下觀察JDP2、Phf2 蛋白表達；④隨訪情況：采用電話及門診檢查相結合方式進行隨訪，納入本文后第1 年，每3 個月隨訪1 次，第2 年開始每6 個月隨訪1 次，隨訪至患者死亡或納入36 個月止，記錄65 例NSCLC 患者總生存率（overall survival，OS）；隨訪期間無人失訪，能獲取完整臨床資料。

三、觀察指標

由兩名臨床經驗＞5 年的病理科醫師采取雙盲法對染色結果進行判讀［6-7］：每張切片選取5 個高倍鏡視野（×400），測定每個視野下JDP2、Phf2 陽性面積及平均光密度，每例最終測量值以5 個視野下陽性面積及平均光密度的平均值為準；當細胞核中出現棕黃色顆粒，即判定為陽性表達，根據陽性細胞百分率分為4 個等級：0 分：＜5%；1 分：5 ～25%；2 分：25～50%；3 分：＞50%；最終結果相乘將＜2 分判定為陰性、≥2 分判定為陽性，記錄JDP2、Phf2 陽性表達率；分析JDP2、Phf2 蛋白表達水平與NSCLC 患者性別、年齡、BMI、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤轉移、腫瘤分期、病理類型等臨床病理特征關系；根據生存情況分為存活組和死亡組，比較2 組臨床資料及JDP2、Phf2 蛋白陽性表達率。

四、統計學方法

使用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，計數資料比較采用卡方（χ2）或Fisher 確切概率法檢驗；Spearman 檢驗相關性；以P＜0.05 表示比較結果有統計學意義。

結 果

一、JDP2、Phf2 表達特征

JDP2、Phf2 蛋白主要定位于細胞核或細胞膜中，呈黃色或棕黃色顆粒，免疫組織化學染色下的陽性表達特征見圖1、圖2；癌旁組織中JDP2、Phf2 陽性表達率高于癌組織中JDP2、Phf2 陽性表達率（P＜0.05），見表1。

表1 JDP2、Phf2 陽性表達率（n）

圖1 JDP2 在癌旁組織（左）和癌組織（右）中的表達

圖2 Phf2 在癌旁組織（左）和癌組織（右）中的表達

二、JDP2、Phf2 在NSCLC 組織中共同表達的相關性分析

65 例NSCLC 組織中，33 例JDP2（＋）和Phf2（＋）同時存在，30 例JDP2（-）和Phf2（-）同時存在，1 例JDP2（＋），1 例Phf2（＋）；采用2×2 配對資料關聯性分析兩者關聯性，結果JDP2、Phf2 在NSCLC 組織中共同表達呈負相關關系，二者具有協同作用（χ2＝53.531，P＜0.001，關聯強度＝0.684）。

三、JDP2、Phf2 與NSCLC 患者臨床病理特征的關系

不同年齡、性別、BMI、腫瘤直徑、腫瘤病理類型的NSCLC 患者JDP2、Phf2 表達量比較無顯著差異（P＞0.05）；分期Ⅲ期、出現腫瘤轉移的NSCLC 患者JDP2、Phf2 陽性表達率低于分期Ⅰ／Ⅱ期、無腫瘤轉移NSCLC 患者JDP2、Phf2 陽性表達率，而分化程度高級的NSCLC 患者JDP2、Phf2 陽性表達率高于分化程度低級的NSCLC 患者JDP2、Phf2 陽性表達率（P＜0.05），見表2。

四、隨訪期間生存結果比較

3 年隨訪期間存活患者42 例（64.62%），死亡23 例（35.38%）。腫瘤直徑＞3 cm、TNM 分期Ⅲ期、出現腫瘤轉移、JDP2 陰性、Phf2 陰性的NSCLC 患者存活率低于腫瘤直徑≤3 cm、TNM 分期Ⅰ／Ⅱ期、無腫瘤轉移、JDP2 陽性、Phf2 陽性的NSCLC 患者（P＜0.05），見表3。

表3 隨訪期間生存結果比較（n）

討 論

JDP2 為轉錄活化因子1 抑制物，可對相應區域組蛋白進行轉錄、修飾、結合和激活，對特異性癌基因活性及其他二聚體均有一定抑制作用。研究顯示，JDP2 過表達導致孕酮受體應激后細胞活力增加并促進細胞凋亡以促進特異性蛋白依賴性轉錄，說明其對腫瘤可能具有抑制和促進轉錄雙重活性［8］。張裔麒元等［9-10］研究乳腺癌患者JDP2 表達量發現，JDP2 通過抑制活性氧誘導的RNA XIST 細胞轉化抑制乳腺癌細胞增殖和分化，提示其可抑制腫瘤發生和發展。而也有研究通過JDP2 蛋白誘導淋巴瘤細胞因子發現，癌細胞迅速增殖且惡性迅速增強，提示JDP2 可能引起的基因組改變與疾病發展密切相關［11］。Phf2 為KDM7 新成員，作為神經元分化和顱面發育必需蛋白，已有多項報道證實其與癌癥的遺傳改變有關［12-13］。Zheng 等［14］指出Phf2 在淋巴瘤細胞中呈高表達水平，表明其與腫瘤發生和發展密切相關；Jeong 等［15］指出Phf2 在腎透明細胞癌中異常下調，表明其可負向調控腫瘤發生和發展；而孫翠翠、劉謙等［16-17］在探討NSCLC 發展為晚期NSCLC危險因素中發現Phf2 為獨立影響因素；Phf2 可影響腫瘤抑癌基因或癌基因激活或失活，有望為腫瘤早期診斷和及時干預提供新靶點。本文分析JDP2、Phf2 共同表達的相關性，結果顯示JDP2、Phf2 在NSCLC 組織中共同表達呈負相關關系，二者具有協同作用（P＜0.001，關聯強度＝0.684），提示共同檢測有一定價值。

為明確JDP2、Phf2 在NSCLC 中的價值，本文選擇經病理學檢查明確為NSCLC 的病理標本，通過免疫組化染色觀察到癌組織中的JDP2、Phf2 蛋白陽性表達率低于癌旁組織，提示低表達的JDP2、Phf2 蛋白與NSCLC 發病具有一定關系，表達缺失提示預后不良。Fang 等［18］的一項宮頸癌大樣本隨訪資料和劉輝等［19-21］研究顯示，JDP2、Phf2 陽性患者與較小腫瘤大小及TNM 低分期存在顯著正相關關系，與年齡、性別、BMI、既往史等無關，且在Kaplan-Meier 生存分析中可見JDP2、Phf2 陽性表達生存率高于JDP2、Phf2 陰性表達生存率。Nakade 等［22］的一項動物體內和體外實驗結果表明，JDP2 可抑制活性氧產生和DNA 氧化，提示其對瘤細胞形成具有一定抑制作用。既往認為Phf2 高表達與較年輕的年齡組、高分化及較低腫瘤分期呈顯著正相關關系［23-25］，且已證實低表達Phf2 促進腫瘤分化、繁殖和發展［26］。

本文將JDP2、Phf2 表達水平與NSCLC 臨床病理特征進行相關性分析，結果JDP2、Phf2 陽性表達負向調控TNM 分期和癌細胞轉移，而隨著分化程度的提高JDP2、Phf2 表達陽性率升高。與既往資料一致，NSCLC 患者中JDP2 表達量與年齡、性別、BMI等無關；而Phf2 對于年齡不一致仍需進一步分析，本文樣本量少，選擇樣本數據資料有效，可能導致結果有一定誤差。

表2 JDP2、Phf2 與NSCLC 患者臨床病理特征的關系（n）

在NSCLC 病變早期、無淋巴轉移時，JDP2、Phf2表達率高，說明PAX-2 缺失可能發生在癌癥發病早期階段，這對于早期相關分子的檢測和控制有較高價值。分析其作用機制可得，JDP2 和抑癌基因具有相似結構，共同參與正常子宮內膜生長，其水平下降或缺失直接影響肺泡細胞正常生長和功能。報道指出，肺部組織正常生長功能和形態被破壞后，原癌基因和抑癌基因發生變化，誘發癌癥可能性大。相關報道均對Phf2 表達水平作出證實，其在正常組織中均有表達，而一旦組織發生病變，其敏感性高于其他特異性指標，可能異常下調來對抗癌細胞浸潤。JDP2、Phf2陽性患者術后三年生存率顯著高于JDP2、Phf2 陰性患者，且當并存遠處淋巴轉移時，JDP2、Phf2 陽性患者術后三年生存率也和無轉移患者無顯著差異，這一研究結果證實了JDP2、Phf2 陽性對癌細胞進展和預后的預測。本文中NSCLC 惡性程度越高而JDP2、Phf2 陽性表達越低，提示JDP2、Phf2 可作為預測NSCLC 疾病進展的分子標志物。

綜上所述，JDP2、Phf2 與NSCLC 臨床病理分期和特征密切相關，且對生存預后有較大影響，提示對JDP2、Phf2 蛋白的檢測可為NSCLC 的診斷和治療提供新靶點。但由于本實驗樣本量少，且僅采用免疫組化染色法測定相關蛋白表達情況，進一步定量分析JDP2、Phf2 蛋白調控及作用機制需在日后臨床實踐中繼續研究。