端粒酶逆轉錄酶啟動子熱點突變的ARMS-LNA-qPCR檢測方法建立

張 潔，李 方，齊長海，梁國威*

(1.北京大學航天臨床醫學院 檢驗科,北京100049；2.航天中心醫院 病理科)

2013 年科學雜志首次報道了在黑色素瘤家系和患者中檢測到端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子區域-124 bp(C/T，C228T)和-146 bp (C>T，C250T )高突變率(突變率>70%)[1]，該熱點突變在肝細胞肝癌(HCC)組織中的突變率高達60%[2]，已成為肝癌及多種惡性腫瘤的診斷、治療監測和預后評估的重要分子監測靶點[3,4]。

目前，檢測TERT該熱點突變的方法只有二代測序和液滴數字PCR(ddPCR)技術平臺(突變檢測下限分別為0.1%左右和0.1%-0.05%左右)2種方法[5,6]，但皆存在不適用于臨床常規開展等問題。我們以普通PCR擴增含有TERT熱點突變位點的純化產物作為檢測標本，采用等位基因擴增阻滯原理(ARMS)的引物，并結合鎖核酸(LNA)抑制探針，建立了實時熒光定量PCR檢測TERT啟動子熱點突變率方法(ARMS-LNA-qPCR)，并在30例表觀健康人中確定檢測下限。

1 對象與方法

1.1 研究對象

表觀健康者：收集我院2019年3月-2019年5月健康體檢確認的表觀健康志愿者30例，納入標準為：無乙肝、丙肝、藥物肝、酒精肝病史或肝臟蜘蛛痣，實驗室檢查肝、腎功能正常，根據腫瘤標志物和影像學檢查除外惡性腫瘤。其中男性16例，女性14例，年齡范圍21-35歲，平均年齡29.1±3.8歲。本研究通過航天中心醫院醫學倫理委員會審查(項目批號：20190830-YN-01)。

1.2 表觀健康人外周血基因組DNA

EDTA抗凝外周全血200 μl用于基因組DNA提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒(目錄號：DP304-02)，按試劑盒說明操作。提取后的組織DNA立即-80℃凍存備用。

1.3 ARMS-LNA-qPCR方法建立

采用2步法建立TERT啟動子區-124bp(C/T)和-146bp(C/T)突變率檢測方法。第一步富集模板，普通PCR擴增產物純化后作為待檢標本；第二步突變率檢測，以ARMS-LNA-qPCR中ΔCt值(ΔCt值=內參Ct值-突變率標準品Ct值)與突變率標準品建立的標準曲線計算獲得。所建方法的檢測原理、引物、探針及循環條件見國家知識產權局專利申請號201910991396.3。

1.4 直接測序

為了驗證ARMS-LNA-qPCR方法的準確性，30例表觀健康人全部采用直接測序法進行了測序(諾賽基因技術有限公司，北京，中國)。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 ARMS-LNA-qPCR定量檢測TERT突變率標準曲線

采用所建ARMS-LNA-qPCR方法，分別檢測突變率標準品為100%、10%、1%、0.1%、0.05%和0%(100%W)的-124bp(C/T)和-146bp(C/T)突變率，其突變率擴增曲線及△Ct與Lg突變率回歸曲線見圖1。

對于-124位點，ARMS-LNA-qPCR突變率擴增曲線圖(重復2次)顯示檢測突變率的下限達到0.05%(Y=-3.801X+33.02，R2=0.999，P<0.001)，其ΔCt(0.05%M-100%W)=-2.11，這一差值區間可以顯著區分0.05%突變和100%野生樣本。為了監控富集PCR產物質量并校準紫外分光光度計測定濃度所引起誤差，我們采用1011拷貝數/ml突變率標準品重復測定5次，建立了△Ct 值(內參qPCR的Ct值減去ARMS-LNA-qPCR的Ct值)與-124位點突變率的內參突變率標準曲線，結果顯示Lg-124突變率與△Ct 值呈線性關系(P<0.001，R2=0.999)，其突變率回歸方程為-124突變率= 10(0.262×△Ct+4.325)，見圖1(A-1和A-2)。

對于-146位點，ARMS-LNA-qPCR突變率擴增曲線圖(重復2次)顯示檢測突變率的下限達到0.05%(Y=-3.834X+32.097，R2=0.999，P<0.001)，其ΔCt(0.05%M-100%W)=-1.92，這一差值區間可以顯著區分0.05%突變和100%野生樣本。采用1011拷貝數/ml突變率標準品重復測定5次，結果顯示Lg-146突變率與△Ct 值呈線性關系(P<0.001，R2=0.999),其突變率回歸方程為-146突變率= 10(0.261△Ct+3.895)，見圖1(B-1和B-2)。

2.2 ARMS-LNA-qPCR方法檢測下限的判定

3 討論

本研究在ARMS-qPCR的基礎上，采用LNA抑制探針選擇性抑制ARMS-qPCR中突變引物對野生等位基因的非特異性擴增，成功建立了高敏感定量檢測TERT啟動子-124bp和-146bp位點突變率的ARMS-LNA-qPCR方法。該方法定量檢測-124bp和-146bp位點突變率的下限是0.07%和0.05%。

ARMS-LNA-qPCR方法成立的關鍵是LNA抑制探針對野生和突變等位基因的結合具有極強的選擇性。研究顯示，寡核苷酸中1個堿基進行LNA修飾可增加其Tm值3-8℃，如果錯配發生在LNA堿基上，其與DNA親和力則明顯下降，利用這一特性可明顯增加LNA修飾探針對等位基因的區分能力[7]。我們在ARMS-qPCR中逐漸增加LNA抑制探針的濃度，通過比較100%和0%TERT-124和-146突變標準品Ct值的變化，最終選擇0.25 μM(-124位點)和0.2 μM(-146位點)終濃度的LNA抑制探針作為抑制野生等位基因擴增的合適水平。需要注意的是，由于各實驗室條件不盡相同，建議不同實驗室注意LNA抑制探針濃度的優化。

圖1 ARMS-LNA-qPCR方法測定TERT-124bp(C/T) 和-146bp(C/T)位點突變率標準品的擴增曲線及Lg突變率-△Ct值回歸曲線圖

A-1：1011拷貝數/ml突變率標準品擴增曲線圖，ΔCt(0.05%M-100%W)=-2.11 ;A-2：Lg-124突變率與ΔCt值(124內參qPCR的Ct值減去-124 ARMS-LNA-qPCR的Ct值)的突變率回歸曲線；B-1：1011拷貝數/ml突變率標準品擴增曲線圖，ΔCt(0.05%M-100%W)=-1.92; B-2：Lg-146突變率與ΔCt值(124內參qPCR的Ct值減去-146 ARMS-LNA-qPCR的Ct值)的突變率回歸曲線。

我們建立的ARMS-LNA-qPCR方法，采用PCR純化產物在qPCR技術平臺上進行檢測，其TERT-124bp和-146bp位點突變率的檢測下限為0.07%和0.05%，與二代測序和ddPCR檢測下限基本相同。由于qPCR技術平臺是目前臨床常規分子檢測技術平臺，且所建方法采用PCR擴增純化標本進行檢測，因此ARMS-LNA-qPCR方法具有臨床廣泛開展的適用性和多種標本來源的普適性。

綜上所述，本研究建立的ARMS-LNA-qPCR方法靈敏度較高，其敏感性和重復性皆可滿足臨床需要。由于采用qPCR技術平臺和PCR擴增純化標本進行檢測，該方法具有廣泛的臨床應用價值。