一種快速鑒別牛肉中大腸桿菌O157∶H7檢測方法的建立及應用

趙亞男，曾德新，郭德華，蔣 原，蔣魯巖，李鑫妮，陳 偉, 湯 芳，薛 峰，戴建君

腸出血性大腸桿菌O157∶H7是一種危害嚴重的人獸共患病原體，主要通過受污染的食物傳播，如牛肉、奶制品、蔬菜和水果[1]。反芻動物，特別是牛，是大腸桿菌O157∶H7的主要宿主[2-3]。雖然大腸桿菌O157∶H7對成年牛沒有致病性，但卻可以導致人的出血性腹瀉、溶血性尿毒癥綜合征(HUS)以及血栓性血小板減少性紫癜(TTP)。人的感染劑量一般很低，攝入10個活菌就足以引起感染[4-5]，幼兒最容易感染這種微生物[6-7]。由它引起的溶血性尿毒綜合征可導致紅細胞的破壞和腎功能衰竭。據報道，全球平均每年有3 890例溶血性尿毒癥病例，死亡人數達230人[8]。自1982年在美國首次被分離出來，并被認為是一種新型的腸道致病菌[9]，美國又發生了多起該病的暴發流行[10-11]。此外，加拿大[12]、日本[13]等多個國家相繼發生此病原菌引起的暴發感染。我國受此病原菌的威脅也越來越大，自1986年在江蘇徐州首次發現以來，福建、甘肅、安徽等省先后自人畜以及其他動物中分離出O157大腸桿菌[14]。

因此，大腸桿菌O157∶H7的檢測在食品安全、疾病控制、環境保護等領域受到廣泛的關注。鑒于現在主流的檢測方法，如國標法金標準，其檢測靈敏度高，但工序復雜，檢測時間長，并對檢測人員要求高[15]，使其無法及時預防疫情的暴發；如分子生物學方法，其時效快，成本低，但特異性易受引物、環境等因素影響而產生假陽性或假陰性結果[16]。而基于單克隆抗體的ELISA方法檢測病原體具有簡單、靈敏度高、特異性好等優點。因此本研究利用抗O157∶H7特異性單克隆抗體2G5及辣根過氧化物酶標記單克隆抗體2E3 (HRP-2E3)，建立雙抗體夾心ELISA方法，為大腸桿菌O157∶H7提供可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1菌株與抗體 38株O157∶H7和沙門氏菌、志賀桿菌等29株菌種由南京農業大學動物醫學實驗室保存(見表2)，本次實驗所用的2株大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體(2G5、2E3)的雜交瘤細胞由南京農業大學動物醫學實驗室篩選獲得。

1.2主要試劑與設備 脫脂奶、BSA、Tween 20購自南京鼎思生物技術有限公司，10×PBS購自北京索萊寶生物科技有限公司，TMB單組份顯色液、辣根過氧化物酶購自Sigma公司，PCR Kit 購自Takara公司，DNA提取試劑盒購自 TIANGEN公司，新生霉素增菌肉湯購自北京陸橋公司，PCR儀為美國ABI公司，電泳儀、凝膠成像系統均為上海天能公司，酶標儀為西班牙基立福公司。

1.3PCR引物設計與合成 以大腸桿菌O157∶H7的菌體抗原基因rfbE[17-18]為目的基因，參考陳雅君等[19]報道的引物序列(表1)，委托金斯瑞生物技術有限公司合成。

表1 rfbE基因引物序列及預計擴增長度
Tab.1 Primer sequence of rfbE and expected amplification length

引物序列(5'-3')擴增長度/bprfbE-FACTACAGGTGAAGGTGGAATG327rfbE-RTTCCTCTCTTTCCTCTGCGGT

1.4單克隆抗體的純化與標記 凍融實驗室存儲的單克隆抗體腹水，根據Protein A預裝重力柱(上海斯信生物技術有限公司)說明書進行純化并進行SDS-PAGE分析，測定單抗純度后凍存于-80 ℃備用。

取純化后的單克隆抗體2E3，與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯，得到酶標記抗體(HRP-2E3)。采用過碘酸鈉法進行標記[20]，原理是過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，可與加入的IgG上的氨基形成Schiff氏堿而結合。

1.5雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立 以2G5為捕獲抗體，辣根過氧化物酶標記單克隆抗體2E3(HRP-2E3)為檢測抗體建立雙抗體夾心ELISA 檢測方法。具體步驟如下：①抗體包被：將2G5用包被液稀釋至一定濃度后包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；②封閉：PBST洗滌3次后，每孔300 μL封閉液于37 ℃進行封閉；③加抗原：PBST洗滌3次，拍干，加入待測菌液，每孔100 μL，37 ℃孵育；④加酶標抗體：PBST洗3次，拍干，酶標抗體(HRP-2E3)稀釋至適宜濃度后，每孔100 μL，37 ℃孵育；⑤加底物顯色：洗板4次，拍干后每孔加入100 μL TMB單組份顯色液，置于37 ℃避光顯色；⑥終止：用2 mol/L H2SO4終止反應，每孔100 μL，于450 nm波長處測各孔OD值。

為了得到最優檢測體系，分別對2G5包被濃度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)，HRP-2E3檢測濃度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)[21]，封閉液(1%BSA、2%BSA、10%BSA、1%明膠、2%明膠、5%脫脂奶)，最佳封閉時間(60 min、90 min、120 min)，抗原作用時間(45 min、60 min、90 min、120 min)，酶標抗體作用時間(45 min、60 min、90 min、120 min)以及顯色液顯色時間(5 min、10 min、15 min、20 min)進行優化。

1.6雙抗體夾心ELISA靈敏度的檢測 將大腸桿菌O157∶H7培養至對數期(OD600=0.6，平板計數確定濃度為1×108CFU/mL)，0.4%甲醛滅活24 h后，用無菌PBS進行10倍比稀釋得 10～108CFU/mL濃度菌液，按照已優化好的最佳條件進行雙抗體夾心ELISA檢測，每個濃度做3孔平行檢測，確定靈敏度。

1.7雙抗體夾心ELISA特異性的檢測 受試菌株包括38株O157∶H7和29株其它菌種，菌濃度均為108CFU/mL，驗證建立的雙抗體夾心ELISA方法的特異性，同時使用國標方法及PCR方法進行對比驗證。

1.8雙抗體夾心ELISA重復性的檢測 板內重復性檢測，選取1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL這4個濃度進行分析，每個濃度做5個重復，計算其板內變異系數。板間重復性檢測，選擇同樣的濃度在5塊不同的酶標板上不同時間進行檢測，計算其板間變異系數。

1.9 樣品檢測

1.9.1模擬樣品檢測 構建人工污染牛肉樣品，使用建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法，PCR檢測方法和國標培養法對比檢測，驗證所建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法的實用性。

牛肉樣品(購自南京農業大學附近農貿市場)，用超純水沖洗干凈后經組織搗碎機加工成肉餡，用國標培養法確定無O157∶H7自然污染后，置于高壓滅菌鍋內121 ℃滅菌20 min。冷卻后，人工污染大腸桿菌O157∶H7，接種劑量分別為104、103、102、10、1 CFU/25 g，每個接種量設置3個平行，并以無菌生理鹽水作空白對照，取各濃度劑量人工污染樣品和空白無污染樣品25 g于 225 mL 新生霉素增菌肉湯，使用拍擊式均質器連續均質2 min，在37 ℃，100 r/min搖床增菌培養。

增菌至4、6、8、10 h，分別從各濃度增菌液和空白菌液取3份樣品，每份1 mL，800 r/min離心3 min去除沉渣，吸上清，10 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，重懸后煮沸10 min，用上述建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測；同樣取4、6、8、10 h增菌液，每份1 mL，設3個平行對照，PBS洗滌去除油脂和沉渣后，使用TINAGEN試劑盒說明書提取DNA，參考陳雅君等[19]報道的PCR擴增體系進行PCR檢測；參照GB 4789.36-2016，增菌24 h后，對不同濃度人工污染樣品和空白無污染樣品進行國標法檢測。

1.9.2實際樣品檢測 從南京農業大學附近的農貿市場、超市采集100份樣品(牛肉40份、豬肉20份、雞肉20份、鮮奶20份)，用已建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，同時采用國標(GB 4789.36-2016)對比檢測。

2 結 果

2.1SDS-PAGE檢測純化后2E3、2G5抗體純度 結果見圖1，在50 kDa和25 kDa處分別出現兩條蛋白帶，它們分別與鼠IgG重鏈和輕鏈的分子量相符合，說明純化效果比較好。

注：M為蛋白Marker；1為純化前2E3；2為純化后2G5；3為純化前2G5；4為純化后2G5圖1 純化前后2E3、2G5單抗的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of monoclonal antibodies (2E3 and 2G5) before and after purification

2.22G5和HRP-2E3工作濃度的測定 方陣法測定結果見表2，基于檢測效果和經濟性考慮，選擇2G5抗體1∶400稀釋(4.48 μg/mL)，HRP-2E3抗體1∶100稀釋(19.9 μg/mL)為最終工作濃度，此時陽性值OD450≈1，P/N值為26.15。

表2 2G5和HRP-2E3工作濃度測定結果
Tab.2 Results of working concentrations of 2G5 and HRP-2E3

酶標抗體HRP-2E3稀釋倍數單克隆抗體2G5稀釋倍數P值N值1∶1001∶2001∶4001∶8001∶1001∶2001∶4001∶8001∶1001.5171.3421.0640.5090.0380.0650.0400.0581∶2000.3860.3360.3440.2260.0630.0370.0400.0351∶4000.2280.2180.1990.1300.0330.0290.0260.0201∶8000.1620.1890.1510.0900.0500.0320.0330.031

注：P值為陽性樣品OD450nm值；N值為陰性樣品OD450nm值

2.3最佳封閉液及封閉時間的優化 封閉對ELISA反應至關重要，可以減少非特異性吸附，提高反應的靈敏度及特異性。以陽性孔OD450值與陰性對照孔OD450值之比(P/N值)最大為最優條件，經測定5%脫脂奶為最適封閉液(圖2A)，1.5 h為最佳封閉時間(圖2B)。

注：A最適封閉液的確定；B最佳封閉時間的確定圖2 最適封閉液及封閉時間的確定Fig.2 Determination of optimal blocking solution and blocking time

2.4抗原、酶標抗體及顯色液作用時間的優化 反應時間的長短會對OD450nm值產生影響，為提高反應的特異性和靈敏度，本次實驗分別對抗原、酶標抗體及顯色液作用時間進行優化，P/N值最大判定為最優條件。結果如圖3所示，抗原、酶標抗體(HRP-2E3)、TMB單組份顯色液最佳作用時間分別為90 min(圖3A)、45 min(圖3B)、10 min(圖3C)。

圖3 抗原、酶標抗體及顯色液作用時間的優化Fig.3 Optimization of reaction time of antigen, enzyme-labeled antibody and chromogenic liquid

2.5雙抗體夾心ELISA靈敏度檢測 對10～108CFU/mL的8個濃度梯度的菌液進行檢測，結果如圖4所示，每個濃度做3個平行，隨著抗原濃度的降低，檢測OD450nm值也隨之下降(見圖4A)，以測定孔與陰性孔OD值之比大于2.1為陽性的判斷標準，本方法對大腸桿菌O157∶H7的檢測限為 1×105CFU/mL，此時比值為2.21(見圖4B)。

2.6雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性 同時使用建立的雙抗夾心ELISA方法、PCR檢測法和國標方法對38株大腸桿菌O157∶H7和29株其他菌株進行特異性檢測，結果見表3。ELISA檢測方法和國標法相同，38株大腸桿菌O157∶H7檢測結果顯示陽性，其他29株菌株檢測結果為陰性，與預期結果一致，顯示了高度的特異性。PCR檢測法和其他兩種方法的檢出結果也基本一致，但是溫和氣單胞菌出現了假陽性結果，可見相比培養法和免疫學檢測方法，PCR等分子生物學檢測方法在特異性方面還存在一定的弊端。

注：A為每個稀釋度的OD450nm值；B為每個稀釋度的P/N值圖4 雙抗體夾心ELISA靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity test of established double-antibody sandwich ELISA

表3 特異性檢測實驗結果
Tab.3 Results of specific test

菌株編號數量ELISA檢測結果PCR檢測結果國標法檢測結果大腸桿菌O157∶H7ATCC 438591+++EH1-EH3737+++大腸桿菌ATCC 259221---大腸桿菌O127∶H6AH1-11---大腸桿菌O8AH3-41---大腸桿菌O20AH3-521---大腸桿菌O25JS2-31---大腸桿菌O78JS2-51---大腸桿菌O128JS2-311---大腸桿菌K88JS3-71---沙門氏菌JS 5-31---單核細胞增多李斯特菌ATCC1---銅綠假單胞菌ATCC359231---表皮葡萄球菌ATCC122281---最小弧菌CICC104741---霍亂弧菌BNCC2320301---創傷弧菌CICC103831---

表3(續)

菌株編號數量ELISA檢測結果PCR檢測結果國標法檢測結果奇異變形桿菌CMCC490051---普通變形桿菌CMCC490271---弗氏耶爾森菌ATCC237151---副溶血弧菌ATCC338471---枯草芽孢桿菌NJXW 18050281---志賀桿菌NJXW 18050331---金黃色葡萄球菌NJXW 18050011---嗜水氣單胞菌NJXW 18030281---副豬嗜血桿菌NJXW 18011---臘樣芽孢桿菌NJXW 17110011---禽分支桿菌NJXW 1305067 1---鴨疫里氏桿菌NJXW 18030011---溫和氣單胞菌NJXW 18030391-+-鏈球菌NJXW 17110201---

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性

2.7雙抗體夾心ELISA重復性檢測 由檢測結果可知，板內變異系數小于5%(見表4)，板間變異系數小于7%(見表5)，板間變異系數略大于板內變異系數，可能是由于每天環境條件不同，如溫度和濕度變化有關，也可能與溶液的再制備有關，但均小于10%，說明建立的ELISA檢測方法具有較好的重復性和精密度[22-23]。

表4 板內重復性檢測結果
Tab.4 Results of intraplate repeatability test

菌濃度(CFU/mL)1×1081×1071×1061×105A孔1.0961.0070.4480.105B孔1.0070.9640.5070.112C孔1.0160.9340.4780.107D孔0.9920.9440.4950.115E孔0.9950.9480.4880.109平均值(x)1.0210.9590.4830.110標準差(s)0.0430.0290.0220.004變異系數(CV%)4.202.994.623.63

表5 板間重復性檢測結果
Tab.5 Results of interplate repeatability test

菌濃度(CFU/mL)1×1081×1071×1061×105酶標板11.1050.9950.5150.100酶標板21.0670.9590.5310.108酶標板30.9800.93704600.101酶標板41.0290.9900.4940.103酶標板50.9910.8870.4650.091平均值(x)1.0340.9540.4930.101標準差(s)0.0520.0440.0310.006變異系數(CV%)5.054.626.256.15

2.8 樣品檢測

2.8.1牛肉模擬樣品檢測 雙抗體夾心ELISA檢測結果見表6，以測定孔與陰性孔OD值之比大于2.1為陽性的判斷標準，增菌4 h、6 h、8 h、10 h后，檢測靈敏度分別為102CFU/25 g、10 CFU/25 g、1 CFU/25 g、1 CFU/25 g?？梢娊? h增菌培養后，建立的ELISA檢測方法對牛肉中大腸桿菌O157∶H7的檢測限可達1 CFU/25 g。

普通PCR檢測結果見圖5，每個稀釋度設3個平行，增菌4 h、6 h、8 h后，檢測靈敏度分別為104CFU/25 g、102CFU/25 g、10 CFU/25 g，增菌10 h后，才可檢測到1CFU/25 g，且陽性條帶較淺。陰性樣品均無條帶，說明檢測過程無污染。該方法增菌8 h后對牛肉樣品檢測靈敏度只能達到10 CFU/25 g，比ELISA檢測降低一個數量級。

按照國標法操作規范對不同濃度污染樣品和無污染樣品進行檢測，經可疑菌落挑選和大腸桿菌O157∶H7干制生化鑒定試劑盒鑒定，各濃度污染樣均為檢測陽性，且空白樣為檢測陰性，說明國標培養法檢測靈敏度很高，達1 CFU/mL，但是其檢測周期較長，需7 d左右，對于有些H鞭毛不易凝集的菌株，其檢測周期更長。

表6 牛肉模擬樣品檢測結果
Tab.6 Results of beef simulation sample test

樣品劑量(cfu)104103102101空白4 h+++---6 h++++--8 h+++++-10 h+++++-

注：A為增菌4 h；B為增菌6 h；C為增菌8 h；D為增菌10 h；1-3為104 CFU/25 g；4-6為103 CFU/25 g；7-9為102 CFU/25 g；10-12為10 CFU/25 g；13-15為1 CFU/25 g；16-18為陰性樣品；19為陽性對照；20為陰性對照圖5 樣品增菌4、6、8、10 h rfbE基因擴增結果Fig.5 Results of rfbE gene amplification after sample enrichment for 4, 6, 8 and 10 h

2.8.2實際樣品檢測 用已建立的夾心ELISA檢測方法和國家標準方法(GB 4789.36-2016)分別對100份樣品進行檢測，兩種方法結果一致，均為陰性，進一步證明了所建立方法的準確性和實用性。

3 討 論

大腸桿菌O157∶H7是一種嚴重的食源性致病微生物，常常引起食品安全事故，威脅著我們的生命安全[24-25]。因此，建立高效、快速的檢測方法是預防和及時發現該暴發的關鍵因素。單克隆抗體因其具有專一的特異性，性質穩定，一經制備可長時間獲得等優勢而廣泛應用于疾病的診斷。因此，本實驗利用前期制備的2株抗大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體建立夾心ELISA檢測方法。該免疫學方法具有靈敏度高、特異性強和檢測周期短等優點。

包被是雙抗體夾心ELISA實驗非常重要的一步，若抗體包被濃度過低，不能完全覆蓋固相載體表面，使捕獲抗體吸附的抗原量不夠，則可能出現假陰性；若包被濃度過高，抗體分子間的相互作用就會造成蛋白分子層疊，在隨后的洗滌過程中，這些抗體容易被洗去，影響實驗的靈敏度。制得的酶標記抗體需要確定其最適工作濃度，濃度過高，則可使非特異性反應增加，陰性結果偏高；而濃度過低又可影響測定的敏感性。所以本實驗通過方陣法，確定了最佳的抗體包被濃度(4.48 μg/mL)和酶標抗體反應濃度(19.9 μg/mL)。

為了驗證建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法的實用性，設計人工污染牛肉樣品，用ELISA檢測法同PCR和國標培養法進行對比檢測，從靈敏度、檢測時長等因素綜合分析，展現其在實際樣品檢測中的優越性。結果顯示，選擇性前增菌8 h后，ELISA檢測靈敏度可達1 CFU/25 g，比PCR檢測高一個數量級。國標法需增菌18～24 h，才可達到1 CFU/25 g的檢測靈敏度；而完成整個檢測過程，ELISA只需5～6 h，而國標培養法則需要7 d乃至更長時間。由此可見，建立的ELISA檢測法集合了國標培養法檢測靈敏度高、特異性強和PCR法檢測周期短的優點，更能滿足實際應用的需求。

本實驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法對污染樣品的檢測靈敏度高于吳大成等[14]采用雙抗體夾心ELISA的檢測方法，增菌培養12 h后，最低檢測限為0.4～4 CFU/g；黃海燕等[26]40 ℃增菌8 h檢測限為2 CFU，即 0.08 CFU/g；以及宋宏新等[27]增菌14 h，檢測線為0.1～0.2 CFU/g。因此，本檢測方法具有較好的特異性及靈敏度，可用于實際樣品中大腸桿菌O157∶H7檢測。

綜上所述，本次實驗建立的雙抗夾心ELISA檢測方法特異性、靈敏度、精密度良好，優于國標法及普通PCR檢測。但是最近有學者[28]用一種新的方法(紙基夾心ELISA)檢測大腸桿菌，該方法檢測快速，不需依賴酶標儀等昂貴儀器，整個操作過程不到1 h，并且其最低檢測限為1×105CFU/mL，靈敏度較高，可以用于現場即時檢測?？梢灶A見如將所建立的ELISA體系應用于紙基微流控芯片，建立紙基夾心ELISA檢測方法，將會大大縮短檢測的時間及成本，取得更為可觀的效果。

利益沖突：無