皖南地區HLA-Brs34933313基因多態性與腎綜合征出血熱的相關性分析

劉 淦，胡婷婷，陶東東，柳發虎，楊進孫，孫恩濤

腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是人獸共患傳染性疾病，由漢坦病毒屬(Hanta-viruses)各型病毒感染引起，主要是鼠類等嚙齒動物通過排泄物、直接接觸人體等途徑傳播致病[1-2]。在中國，HFRS是嚴重的公共衛生問題，每年發病人數約占據全球90%的比例，我國陜西、河北及山東地區等都是腎綜合征出血熱的多發疫區[3-6]。人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)基因復合體位于人類第6號染色體，經典HLA-I基因具有高度多態性，亦是參與機體免疫的候選基因組之一，通過抗原肽呈遞CD8+T細胞參與免疫反應，在免疫識別病原體感染的細胞的基礎上，誘導表位與宿主免疫系統之間的各種相互作用[7-8]。傳染性和炎性疾病已在HLA中顯示出很強的遺傳關聯，有研究表明，HFRS是由環境因素和遺傳因素相互作用產生，且具有明顯的遺傳傾向，HLA基因與HFRS發病風險的關系在國內已有報道[9-10]。因此，研究疾病的同時還應需要考慮宿主HLA的遺傳背景。

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)通常是最常見的基因組變異，目前已成為研究基因組區域遺傳的理想選擇，通過DNA中的遺傳信息被轉錄為RNA，然后翻譯為蛋白質負責確定人類之間的差異，SNP可分析基因型和表型信息之間的關系，因此遺傳多態性間接影響免疫等生理活動[11]。李琦等[12]篩查河北省HFRS患者HLA功能性基因位點，采用病例對照方法分析HLA基因位點多態性，發現HLA-B基因rs34933313位點更易感染HFRS，但選擇人群分布具有差異。本實驗在此基礎上，首次探討HLA-B基因位點與皖南地區HFRS的關聯，提供HFRS發病機制的科學依據，為臨床前期篩查提供指導方向。

1 材料與方法

1.1材料收集 兩組人群均來源于2018年9月1日至2019年9月1日安徽蕪湖弋磯山醫院。病例組：患者均根據國家統一標準診斷為腎綜合征出血熱[11]，其中男性12例、女性2例, 年齡在27～74歲范圍內，平均年齡(48.86±16.30)歲,且均為漢族人群。對照組：根據年齡、性別、職業等基線資料，從醫院體檢中心隨機抽取不患目標疾病的人群作為健康對照，隨機選取50名漢族地區正常人(無腎綜合征出血熱發病史、或接種相關疫苗)，且各生化成分及各細胞含量均處于正常范圍，其中男25例、女25例，年齡在27～74歲范圍內，平均年齡(48.82±10.23)歲，且均為漢族人群，兩組人群資料經皖南醫學院附屬弋磯山醫院倫理委員會批準收集。兩組各留取新鮮抗凝血24 h內操作，或置于—80 ℃冰箱內冰凍保存后續操作。

1.2試劑與設備 腎綜合征出血熱漢坦病毒IgG抗體(HV-IgG)ELISA定性檢測試劑盒(南京帕爾斯生物科技有限公司)，Epoch酶標儀(美國Biotek)，小型磁力架(上海生工)，磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)，Taq多聚酶(上海生工)，離心機(Eppendorf 5430/R)，PCR儀(Eppendorf)EPS-100核酸電泳儀Power Supply(上海天能Tanon)、通用型化學發光、熒光和可見光成像系統FluorChem FC3(美國Protein Simple公司)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 將采集的血液樣本實驗前進行ELISA試劑檢測，以保證所得樣本準確性，確診后的樣本留作DNA提取，采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒法提取白細胞基因組DNA，置于—20 ℃冰箱儲存備用。

1.3.2引物的設計與合成 參照李琦等[12]針對HLA-B基因rs34933313位點的特異性堿基序列。引物：上游引物F1(5′-CACAGTGCAGCTCACTCAGC-3′)、上游引物F2(5′-CACAGTGCAGCTCACTCAGG-3′)和下游通用引物RP(5′-TGGTGGTCTACCCTTGGA-3′)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.3PCR擴增分型 采用ASP-PCR技術擴增HLA-B基因rs34933313位點的186 bp片段。反應體系為：基因組DNA3.5 μL，Taq酶0.4 μL(5 U/μL)，dNTP0.1 μL(10 mmol/L)，5×buffer (含Mg2+)4 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/ L)，無酶dd H2O 10 μL。反應條件為：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環35次；72 ℃延伸7 min。

1.3.4PCR擴增結果檢測 取5.0 μL PCR擴增產物，在電壓100 V，35 min下用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下記錄結果。

1.3.5電泳結果判斷 若F1擴增出來，而引物F2沒有，則此位點的等位基因W/W為純合子。若F2擴增出來，而引物F1沒有，則此位點的等位基因M/M為純合子。若兩個引物F1、F2都擴增出條帶，則此位點的等位基因W/M為雜合子。

1.3.6統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg，H-W)遺傳平衡檢驗，判斷所選人群是否具有代表性。兩組基因分布差異采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗比較計數資料，使用logistic回歸模型和95%可信區間(CI)評估兩組數據的危險度(OR)，并建立加性、隱性和顯性遺傳模式，所有統計過程均使用雙側檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結 果

2.1ELISA試驗 ELISA試驗檢測患者組樣本均為陽性，對照組樣本均為陰性，檢測后樣本進行DNA提取。

2.2基因位點分型 基因組DNA電泳出現的條帶清晰，完整且無缺損，長度均超過2 000 bp。將其用于HLA-B基因rs34933313位點分型，規定從左向右開始計數條帶泳道，起始為第1道,共25道電泳。

注：第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12路徑是G等位基因特異性引物PCR的結果；第14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25路徑是C等位基因特異性引物PCR的結果；第1和14、2和15、3和16、4和17、5和18、6和19、7和20、8和21、9和22、10和23、11和24、12和25為同一基因樣本；DNA標志物：2 000 bp Marker。圖1 HLA-B基因rs34933313分型引物的電泳PCR產物Fig.1 Electrophoretic PCR products of HLA-B gene rs34933313 typing primers

2.3 數據分析

2.3.1哈德溫伯格平衡檢驗 HLA-B基因rs3493331位點的等位基因為G/C兩種形式，野生型為G、變異型為C，則可分為GG、CG、CC 3種基因型。利用哈溫平衡定律HLA-B rs34933313位點的對照組觀察人群檢驗，此位點實際人群分布基因型頻率與預期人群分布頻率比較，差異無統計學意義，表明對照組研究樣本均都具有群體代表性，見表1。

表1 對照人群分布哈德溫伯格平衡檢驗
Tab.1 Hadwinberg equilibrium test among Distribution of control population

對照人群分布SNPGGn(%)CGn(%)CCn(%)χ2值P值實際分布22(44.00)24(48.00)4(8.00)0.220.9預期分布23(46.00)22(44.00)5(10.00)

2.3.2HLA-B rs34933313位點與腎綜合征出血熱易感性分析 經過Hardy-Weinber平衡檢驗HLA-B rs34933313滿足遺傳平衡、具有群體代表性，得出等位基因頻率在病例組和對照組中的差異有統計學意義(χ2=4.38，P<0.05)，顯示攜帶C等位基因可增加HFRS發病風險(OR=2.45，P<0.05)。HLA-B基因SNP rs34933313的基因型頻率在病例組和對照組之間分布差異具有統計學意義(χ2=6.47，P<0.05)(見表2、3)。

表2 HLA-B基因rs34933313位點等位基因頻率分布[例(%)]
Tab.2 Allele frequency distribution of HLA-B rs34933313 [cases (%)]

組別等位基因GCχ2值P值OR病例組n(%)13(46.43)15(53.57)4.380.042.45對照組n(%)68(68.00)32(32.00)

表3 HLA-B基因rs34933313位點基因型頻率分布[例(%)]
Tab.3 Genotype frequency distribution of HLA-B rs34933313 locus [cases (%)]

組別基因型GGGCCCχ2值P值病例組n(%)1(7.14)11(78.57)2(14.29)6.470.04對照組n(%)22(48.00)24(8.00)4(11.00)

2.3.3不同遺傳模型HLA-B基因rs34933313位點比較 對上述基因趨勢P<0.05的SNP位點作進一步分析。從遺傳模型分析(表4)：加性模型：GG Vs CC、隱性模型：CC Vs GG+GC，顯性模型：CC+GC Vs GG。HLA-B基因rs34933313位點基因型的加性模型(GG Vs CC)的OR值是11.00(95%CI=0.80～152.04)，差異無統計學意義(P>0.05)；隱性模型(CC Vs GG+GC)的OR值是1.91(95%CI=0.31～11.74)，差異無統計學意義(P>0.05)；顯性模型(CC+GC VsGG)的OR值是10.21(95%CI=1.24～84.18)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表4 HLA-B rs34933313位點基因型在不同遺傳模型下的比較
Tab.4 Comparison of HLA-B rs34933313 genotypes in different genetic models

遺傳模型基因型病例組n(%)對照組n(%)OR值95%CIχ2值P值加性模型CC2(66.67)4(15.38)11.000.80～152.04-0.10①GG1(33.33)22(84.62)1-隱性模型CC2(14.29)4(8.00)1.920.31～11.740.040.85②GC+GG12(85.71)46(92.00)1-顯性模型CC+GC13(92.86)28(56.00)10.211.24～84.186.450.01GG1(7.14)22(44.00)1-

①Fisher精確概率法，②連續校正卡方檢驗

3 討 論

HFRS是一種人獸共患性傳染病，臨床特征是發熱、低血壓休克、充血出血，隨著時間的推移會嚴重損害腎臟等[13]?；蚺c環境因素共同作用和調控導致HFRS發生，其潛在機制亦與免疫反應有關[14]。研究發現免疫因子的釋放可影響炎癥期間細胞因子含量調節，影響漢坦病毒感染，另外HFRS誘發與宿主基因差異有關，提示應重視寄生宿主發病風險的本質[15]。單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是基因分型的常用方法，全外顯子測序(Whole Exon Sequencing，WES)的應用可篩查突變基因位點，有助于更多傳染性疾病的遺傳因素的研究[16-17]。

HLA基因多態性與HFRS發病風險關聯多有報道，顯示出兩者之間有緊密聯系。秦娜琳等[18]發現HLA-A*3101、HLA-B*5801、HLA-DRB1*1602基因位點可增加發病風險，HLA-B*4001作為保護因素，但基因型攜帶的患者數量較少。CTL在HFRS過程發揮重要作用，保護性基因的表達產物介導CTL具有較強效應能力，抵抗疾病發生，反之易感性基因表達蛋白使抗原提呈不足等，使CTL功能減退或消失，導致免疫功能損傷使疾病易感[19]。HLA基因多態性與HFRS的易發風險及病程嚴重度有關，深入對HLA基因位點及單倍型的關系研究可協助臨床早期篩查及診斷[20]。通過對漢坦病毒(Hantaan virus，HTNV)感染下的不同臨床病程HFRS患者分析，發現HFRS嚴重臨床進程與患者所攜帶的HLA-B*46基因位點、單倍型HLA-B*46-DRB1*09和HLA-B*51-DRB1*09有關，同時患有輕度臨床進程的患者中HLA-DRB1*12等位基因出現頻率較高，提示此位點可能是保護因素，說明了HLA基因與HFRS的易感性有顯著相關性，為往后HLA基因多態性對HFRS研究開展提供新的理論方向[21-22]。

本研究結果顯示HLA-B基因rs34933313位點病例組GC基因型頻率明顯高于對照組，提示HLA-B基因rs34933313位點GC基因型可能與HFRS相關。病例組C等位基因頻率明顯高于對照組，且攜帶C等位基因罹患HFRS的概率是G等位基因的2.45倍，會增加HFRS的發病風險，猜測在遺傳信息表達過程中該位點G突變為C導致氨基酸替換或缺失，進而導致編碼免疫蛋白的改變，從而產生對疾病的易感性。提示皖南地區漢族人群HLA-B基因rs34933313位點與HFRS患者發病風險存在相關性。但本研究篩選樣本數量有限，并且覆蓋人群僅在皖南地區，具有一定的局限性，下一步將擴大樣本進行研究，并尋求更多HLA-B易感基因位點，深入對HFRS遺傳易感性的相關機制的研究。

利益沖突：無