廣州市香港海鷗型菌紅霉素耐藥性與基因分析

張錚峰，張冰純，王盼盼，陳定強，趙路寧，余 琳

香港海鷗型菌屬原核細菌(Proteobacteria)I3亞綱，奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)，學名為香港海鷗型菌(Laribacterhongkongensis，LH)。它是新發現的被證實與社區性胃腸炎和旅行者腹瀉有關的細菌[1]。它和產酸克雷伯菌 (Klebsiellaoxytoca)、產腸毒素脆弱擬桿菌 (EnterotoxigenicBacteroidesfragilis,ETBF) 被美國學者確認為21世紀來新發現的3種可以引起人急性腹瀉的病原菌[2]。淡水魚和蛙類是該菌的主要宿主[3]。在2012年，我們課題組在廣州醫科大學附屬第一醫院的門診腹瀉病人糞便標本中首次發現多重耐藥的香港海鷗型菌[4]，命名為HLGZ1，此菌對革蘭氏陰性桿菌的臨床常用抗生素均耐藥，因此我們開始觀察其他類抗生素(如紅霉素等)的耐藥情況，以及紅霉素耐藥相關基因ereA、ereB、ermA、ermB、ernC、MefA/E、mphA、SAT4、MsrA的攜帶情況，分析該菌對紅霉素耐藥的基因狀態，以便進一步為臨床正確用藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 2016年1-9月期間，從廣州8個不同的零售市場采集草魚和青蛙腸道標本，通過分離培養，生化鑒定和香港海鷗型菌16S rRNA基因特異性序列測序，最終確定122株為香港海鷗型菌株，由廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科保存。其中魚源株85株，蛙源株37株。

1.1.2主要試劑 血瓊脂平板、紅霉素藥敏紙片(環凱公司)，MH平板、營養肉湯(生物梅里埃公司)，DNA提取試劑盒、200 bp Maker Ⅲ(天根有限公司)。引物合成自生工生物工程(上海)股份有限公司，PremixTaqDNA 聚合酶為TaKaRa 公司產品。

1.1.3標準菌株 大腸埃希氏菌ATCC25922 和金黃色葡萄球菌ATCC25923由廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科保存，并作為藥敏試驗的質控菌株。

1.1.4主要儀器 PCR擴增儀(伯樂公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像分析系統(英國Syngene 公司)、生物安全柜(Thermo公司產品)、生物培養箱LRH-250A(廣州醫療器械廠)、低溫超速離心機(Eppendorf公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學儀器廠)和0.5麥氏比濁儀(梅里埃公司)。

1.2 方 法

1.2.1紅霉素的耐藥性測定 按照CLSI的紙片擴散法(K-B法)測定122株香港海鷗型菌對紅霉素的敏感性。使用游標卡尺測量抑菌圈并記錄，結果判讀根據CLSI標準進行。

1.2.2DNA模板的制備 采用天根柱式DNA提取試劑盒，按照說明書提取菌體DNA。將提取的模板DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3紅霉素耐藥基因檢測

1.2.3.1引物 參照文獻[5-7]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E,mphA,SAT4紅霉素耐藥基因的引物。

1.2.3.2PCR反應體系的配置 反應體系共25 μL，其中包括12.5 μL pcr mixTaqDNA聚合酶、10.5 μL雙蒸水、上下游引物各0.5 μL和1 μL DNA模板。PCR 反 應 條 件 為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性 30 s， 50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，34 個循環；最后 72 ℃延伸 3 min。

1.2.3.3PCR產物分析 取0.6 μL擴增產物加樣于1.5%瓊脂糖凝膠中(使用DD染料配制)，在130 V電壓下電泳15 min，用凝膠成像系統觀察并保存圖片。

2 結 果

2.1藥敏結果 122株香港海鷗型菌對紅霉素耐藥率為29.5%(見表1)。

表1 122株香港海鷗型菌的耐藥性
Tab.1 Drug resistance of LH(122)

抗生素名稱魚源株(n=85)蛙源株(n=37)合計(n=122)耐藥株耐藥率%耐藥株耐藥率%耐藥株耐藥率%紅霉素2225.91335.13528.7

2.2耐藥基因分布 只在蛙源耐藥株中檢出紅霉素抗性基因ereA，檢出率為30.8%，提示海鷗菌蛙源株對紅霉素產生的耐藥性與ereA基因相關(見表2)。

2.3耐藥基因檢測結果 420 bp處出現ereA目標條帶(見圖1)。

注：M為Marker；1為ereA(420 bp)；3為ereA(420 bp)；4為ereA(420 bp)圖1 耐藥基因(ereA)PCR電泳結果Fig.1 PCR result of resistance gene(ereA)

表2 耐藥基因攜帶情況
Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

抗生素基因魚源株(n=22)蛙源株(n=13)合計(n=35)檢出株檢出率(%)檢出株檢出率(%)檢出株檢出率(%)ereA00430.8411.4ereB000000ermA000000ermB000000紅霉素ermC000000MefA/E000000msrA000000mphA000000Sat4000000

2.4部分基因測序結果 通過與GenBank上的ereA基因(編號AF466410.1)比對，同源性達99%(圖2)。

圖2 測序結果Fig．2 Sequencing result

3 討 論

由于廣東省地處珠江三角洲地區, 毗鄰香港，屬亞熱帶氣候,溫熱多雨, 居民素喜食魚、蝦、蟹等淡水產品, 因此，存在引發人群食源性疾病的潛在危險。目前國內和國外均有香港海鷗型菌所致人胃腸炎的臨床病例報道,香港地區為首次報道從社區胃腸炎患者糞便中培養出香港海鷗型菌[1]；我國內地浙江省杭州市及廣東省江門市均發現腹瀉患者大便標本中存在該菌，并確定該菌是患者腹瀉的病原菌[8-9]，香港海鷗型菌在世界各國如丹麥、美國、韓國等地均有人體感染致腹瀉或胃腸炎的報道[10-12]，說明香港海鷗型菌是導致人類腹瀉病原菌之一，而且作為一種新發現的病原菌，在世界范圍內廣泛存在，但其致病機制與耐藥機制尚不明確。在2012年，我們團隊在腹瀉病人糞便發現泛耐藥HLGZ1中存在很多耐藥基因，插入序列和I類整合子等元件，表明耐藥基因在香港海鷗型菌中存在水平傳播的現象[4]。

目前，我國濫用抗生素的情況依然十分嚴重，多重耐藥甚至泛耐藥細菌的出現應當起人們的警惕。故本課題組開展香港海鷗型菌紅霉素耐藥性研究對于預防和治療其引起的感染具有重要意義。本研究122株香港海鷗型菌中對紅霉素耐藥株有35株，耐藥率達28.7%，表明香港海鷗型菌對紅霉素耐藥較為嚴重。這與以往廣州地區研究結果相吻合，如王祉蘊等[13]分離的54株LH中有15株對紅霉素耐藥，耐藥率為27.78%；王麗等[14]分離的122株海鷗菌有23株對紅霉素耐藥，耐藥率為18.9%。但不同地區間有差異，馮梅等[15]在深圳地區分離的108株LH中有6株對紅霉素耐藥，耐藥率為5.56%。

本研究同時發現蛙源株對紅霉素的耐藥率比魚源株要高；同時檢測常見導致細菌紅霉素耐藥的基因：ereA和ereB(通過表達紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活引起細菌耐藥)、ermA、ermB和ermC(通過表達紅霉素甲基化酶，導致細菌核糖體23sRNA基因甲基化，紅霉素對其作用失效而耐藥)、MeFA/E(編碼轉運蛋白將紅霉素類藥物泵出細菌細胞外而導致耐藥)和mphA(其表達產物可以使紅霉素脫氧二甲胺己糖C-2位置發生磷酸化或糖基化而失去活性)。結果只在蛙源耐紅霉素株中檢出其相關抗性基因ereA，檢出率為30.8%，提示海鷗菌蛙源株對紅霉素產生的耐藥性與ereA基因相關，可能通過ereA基因表達紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活，引起對紅霉素耐藥；而紅霉素耐藥的魚源株耐藥性與ereA無關。

香港海鷗型菌自發現至今已有18年，大部分的文獻報道均針對該菌的分離情況和表型進行研究。近年來開始對該菌的致病機制和耐藥機制進行深入研究。而該菌對紅霉素耐藥及傳播機制仍不明確，國內外均無相關文獻報道。故本研究通過對香港海鷗型菌紅霉素耐藥株的相關耐藥基因ereA，ereB，ermA，ermB，ernC，MefA/E，mphA，SAT4進行分析，為進一步探究香港海鷗型菌對紅霉素的耐藥機制和臨床防治耐藥株提供實驗室數據。

香港海鷗型菌的主要宿主是水產品(淡水魚和蛙)，多種抗生素耐藥菌的出現應引起養殖業對濫用抗生素的警惕，建議對抗生素市場進行更嚴格的監管。

利益沖突：無