D混料最優設計優化茶多酚微膠囊工藝及其脂肪氧化抑制作用

劉芝君,黃業傳,夏 嶼,卿 蘭,王 洋

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

微膠囊化過程中包埋的粒子組分被稱為“芯材”,用來包埋芯材的聚合物被稱為“壁材”、“殼”、“涂層”、“載體”或“密封劑”等[1]。茶多酚(TP)主要由茶葉制備而來,具有抗菌和抗氧化活性,在食品工業中被作為防腐劑和抗氧化劑,特別在加工肉制品的貯藏領域表現出良好前景[2]。而多酚分子中存在不飽和鍵,使其非常不穩定,易受氧化劑、光、熱、pH等環境因素的影響[3],且跟其他多酚一樣具有不良風味,在加入食品或口服藥品之前必須掩蓋這些味道[4]。茶多酚微囊化就能保護其避免各種環境因素的影響,以延長保質期和穩定性[5],防止不必要的味道和風味[6],同時根據不同條件以受控制的形式釋放[7]。

已有許多將茶多酚添加到肉制品中抑制脂肪氧化的研究,如Faisal等[8]將綠茶提取物加入到牛肉中于4 ℃貯藏1、4、8、12 d,其研究結果表明,綠茶提取物能高效減少脂質氧化和酸敗;Fan等[9]等通過在豬肉香腸中添加0.03%的茶多酚和不添加茶多酚的處理比較,研究發現茶多酚可以有效提高豬肉香腸的質量特性并延長其保質期。茶多酚微膠囊的制備方法已相當成熟,包括噴霧干燥[10]、冷凍干燥[11]、電噴[12]、脂質體和納米脂質體[13]、高速剪切均質和高壓均質[14]、成膜封裝[15]等,而茶多酚微膠囊在肉制品中的實際應用還較少。

目前大多研究采用正交實驗或Box-Behhken實驗設計優化微膠囊制備工藝[16-17],本文采用混料設計中的D-optional方法優化自組裝法制備茶多酚微膠囊,具有試驗次數少、多目標同步優化、預測參數精密度高等特點[18],并結合電子鼻檢測不同條件處理后肉制品風味變化情況,研究茶多酚微膠囊對豬肉脂肪氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬背肉 購于某超市;茶多酚、殼聚糖 食品級,鄭州康本生物科技有限公司;明膠 食品級,河南博洋明膠有限公司;冰乙酸、無水乙酸鈉、沒食子酸、無水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、可溶性淀粉、三氯甲烷、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、EDTA-2Na 均為分析純,成都科龍試劑廠;福林酚 上海源葉生物科技有限公司。

PHS-2F型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;DF 101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;CR22GⅢ高速冷凍離心機 日本Hitachi Koki公司;FreeZone 2.5真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;UV 1000單光束紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州市金壇華特實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的制備 根據GB/T 31740.2-2015 茶制品第2部分:茶多酚[19]的檢測方法進行制備。按照福林酚法測定茶多酚含量,制備濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸標準溶液,作校正標準定量茶多酚。以沒食子酸的吸光度為縱坐標(y),其質量濃度為橫坐標(x)作線性回歸,得到標準曲線為:y=0.0108x+0.0021,R2=0.9994。

1.2.2 茶多酚-明膠-殼聚糖納米微粒的制備 根據Chen等[20]、張力等[21]的方法,稍作修改,稱取一定量的明膠和殼聚糖,分別溶解在0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中,配制成0.2%的明膠溶液和0.2%的殼聚糖溶液。稱取一定量的茶多酚溶解在一定量的0.2%的殼聚糖溶液中,室溫下緩慢滴入裝有一定量的0.2%明膠溶液的100 mL小燒杯中,放入轉子,置于恒溫磁力攪拌器上,轉速為300 r/min,攪拌30 min,攪拌結束后在60 ℃恒溫水浴加熱20 min,即得到茶多酚-明膠-殼聚糖納米粒懸浮液。以包封率為因變量,考察體系中茶多酚、明膠、殼聚糖的合適含量。

1.2.2.1 明膠含量對可溶性復合物形成的影響 將0.2%明膠溶液滴入10 mL 0.2%殼聚糖溶液中,以試驗體系干物質質量總量為1,在600 nm波長處測定殼聚糖和明膠混合溶液質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)的吸光度,此時體系中明膠含量分別為0.50、0.67、0.75、0.80、0.83、0.86,0.2%殼聚糖溶液為測定的空白對照。以濁度及形成可溶性復合物的穩定性為評價指標,探究確定體系中明膠與殼聚糖復合凝聚反應形成可溶性復合物的合適含量[21]。

1.2.2.2 茶多酚含量對包封率的影響 試驗體系干物質質量總量為1,固定明膠-殼聚糖質量比為3∶1,稱取一定量的茶多酚,按體系中不同的茶多酚∶明膠質量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶10)添加,此時體系中茶多酚含量分別為0.43、0.27、0.20、0.11、0.07,測定其包封率,同時結合懸浮液穩定性確定合適的茶多酚含量范圍。

1.2.3 D-混料最優設計優化 納米粒制備工藝根據單因素實驗結果運用Design Expert 8.0.6,采用混料設計中D-optional的方法,體系中各成分干物質含量總和為1,以體系中茶多酚含量(A)、明膠含量(B)、殼聚糖含量(C)為自變量,包封率為響應值進行試驗設計。

1.2.4 不同茶多酚處理對豬肉脂肪氧化的影響 取新鮮肥瘦比例為4∶6的豬背肉,絞碎,將肉糜分成每200 g一份備用,每一組按表1分別添加不同質量比例的茶多酚和由上述混料設計優化配方后得到的茶多酚微膠囊,添加前用20 mL無菌蒸餾水溶解,然后與肉糜混合均勻,空白處理僅添加20 mL無菌蒸餾水。每一份肉樣平鋪于密封袋中置于4 ℃條件下冰箱中貯藏,在第0、1、2、4、6、8、10 d測定其丙二醛含量(TBARs值),并采用電子鼻測定其對風味的影響。

表1 樣品處理

1.2.5 檢測指標

1.2.5.1 包封率的測定 將制備得到的茶多酚-明膠-殼聚糖納米懸浮液在17000×g的條件下離心30 min,取上清液按照1.2.1中的方法測定并計算茶多酚的含量,計算包封率,沉淀冷凍干燥即為茶多酚微膠囊。

1.2.5.2 TBARs值的測定 采用GB 5009.181-2016《食品安全標準食品中丙二醛的測定》的分光光度法[22]。

1.2.5.3 電子鼻測定及主成分分析 取貯藏第10 d均勻的1.0 g樣品于15 mL頂空進樣瓶中,雙層保鮮膜封口,在常溫下放置30 min后采用頂空吸氣法進行電子鼻檢測分析,每個樣品重復3次。電子鼻的采樣參數設置為:樣品測定間隔時間1 s,傳感器自動清洗時間60 s,傳感器歸零時間10 s,進樣準備時間5 s,分析采樣時間70 s,進樣流量400 mL/min。隨后提取電子鼻各傳感器特征值,利用PEN3傳感器配套的Winmuster軟件對數據進行主成分分析(PCA)。為保證實驗數據的穩定性和精確度,選取測定過程中的50～52 s的數據用于后續分析。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,利用Excel、SPSS及Design-Expert軟件對實驗數據進行處理并加以分析。不同平均值之間采用鄧肯多重比較進行差異顯著性檢驗,P<0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 茶多酚-明膠-殼聚糖微粒的制備

2.1.1 明膠含量對可溶性復合物形成的影響 由圖1可知,隨著明膠在體系中的含量增加,體系吸光度緩慢上升,濁度增加。試驗中使用明膠為B型明膠,其等電點為4.8,體系pH為5.4高于其等電點,則此時明膠帶負電荷,而殼聚糖因含有大量氨基在此條件下帶正電荷,二者通過兩性靜電相互作用產生復合凝聚反應,形成凝聚物[23]。當兩者比例超過3∶1,即明膠含量超過0.75時體系濁度迅速增大,且有白色絮狀凝聚物析出,體系不穩定,故確定明膠含量范圍為0.50～0.75。

圖1 明膠含量對聚合物濁度的影響

2.1.2 茶多酚含量對包封率的影響 由圖2可知隨體系中茶多酚含量增加,茶多酚微膠囊包封率也顯著增加,在茶多酚處于較低含量時,體系呈現為乳光懸浮液,超過一定含量后,體系有絮凝沉淀產生。當茶多酚含量超過0.43時,茶多酚在體系中溶解性變差,形成大塊絮凝。根據張茵等[23]研究結果表明隨著茶多酚含量的增加,其包封率增大,粒徑也在增大,但超過一定比例后,其粒徑超過微粒要求,且懸浮液不穩定,則確定茶多酚含量范圍為0.20～0.43。

圖2 茶多酚含量對包封率的影響

2.2 不同配比對包封率的影響

2.2.1 D-混料最優設計 以試驗體系中干物質質量總和為1,由2.1的實驗結果得到各因素實際含量,實驗采用D-optional混料設計,經試驗設計調整后確定體系中茶多酚含量為0.25～0.40,明膠含量為0.50～0.65,殼聚糖含量為0.10～0.25,考察茶多酚-明膠-殼聚糖納米粒包封率,試驗設計及結果如表3所示。以包封率為響應值,應用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據結果進行二次項式回歸分析,得到數學模型如下:

表3 D-混料最優設計及結果

包封率=51.07A+39.71B+40.05C+1.93AB+10.73AC+4.72BC

表2 混料設計因素和水平表

表4 試驗結果方差分析

從圖3中可以看出,響應面基本呈現出曲面趨勢,說明各組分之間存在交互作用。從得到的數學模型和圖3中可以看出茶多酚含量對包封率的影響最大,隨含量在一定范圍內增大,包封率隨之顯著提高,在體系茶多酚含量較低時,茶多酚分子未與明膠分子進行期望的氫鍵或疏水作用力相互交聯進行包埋行為,而是通過弱相互作用力依附在明膠分子表面[24],試驗測試包封率時通過高轉速離心力可以使其小分子分離,導致在低茶多酚含量時包封率較低。

圖3 不同配比對包封率的影響

2.2.3 驗證試驗 采用Design Expert 8.0.6軟件的優化功能,以最大包封率為目標進行配方優選,選擇期望值最大的一組進行驗證試驗。得到最優配方為茶多酚含量為0.40、明膠含量為0.50、殼聚糖含量為0.10,預測包封率為51.10%;按最優配方進行驗證試驗,三次實驗重復,得到實際包封率為50.87%±0.25%,與實驗預測值接近,說明采用D-混料最優設計進行茶多酚-明膠-殼聚糖微膠囊的工藝優化配方較準確。張力[21]采用自組裝法以殼聚糖濃度、明膠濃度、丁香酚濃度為正交試驗試驗指標,優化丁香酚-明膠-殼聚糖納米微粒的制備工藝,得到丁香酚-明膠-殼聚糖納米微粒的最優工藝下包封率為 50.69%,與本方法試驗結果相似。

2.3 不同茶多酚處理對豬肉脂肪氧化的影響

2.3.1 不同茶多酚處理對豬肉TBARs值的影響 TBARs值通常用來評價動物性食品中脂肪氧化分解程度,是脂肪分解所產生的衍生物,如丙二醛等與TBA反應的值,能夠反應脂肪氧化程度[19]。在新鮮豬肉糜中添加不同比例的茶多酚及茶多酚微膠囊,其TBARs值在貯藏期間的變化如表5所示,添加不同茶多酚各組TBARs值在貯藏期的第1 d表現出下降,其原因可能是氧化產物丙二醛與冷卻肉中活性氨基作用生成1-氨基-3-氨基丙烯,從而導致TBARs值下降[23];隨貯藏時間的增加,各處理TBARs值也明顯增加,且貯藏期間(0 d除外)對照組TBARs值均顯著高于添加茶多酚和微膠囊處理組(P<0.05),說明添加茶多酚或者微膠囊茶多酚均能有限抑制脂肪氧化。與尹愛武等[25]研究刺兒茶多酚對冷卻豬肉保鮮效果研究結果相同;孫承鋒等[26]研究蘋果多酚對對鮮肉色澤穩定性及脂肪氧化的影響結果表明添加0.01%～0.1%的蘋果多酚能較好抑制脂肪氧化,隨著蘋果多酚添加量的增大,其抗氧化作用增強,TBARs值降低。有資料提出良質肉TBARs值≤0.664 mg/kg,TBARs值>0.5 mg/kg會有氧化異味產生,變質肉TBARs值>1 mg/kg[19]。貯藏前4 d,添加不同狀態0.01%茶多酚的B、E組TBARs值無顯著差異,C、D組TBARs值則顯著高于F、G組(P<0.05),說明使用本方法制的茶多酚微膠囊能達到良好的脂肪氧化抑制效果。處理第6～10 d,添加茶多酚的B、C、D組TBARs值顯著高于添加相同含量茶多酚微膠囊的E、F、G組(P<0.05),說明茶多酚微膠囊的緩釋作用能有效延長茶多酚的抗氧化效力。處理第10 d,肉樣TBARs值明顯增加，除A組TBARs值>1 mg/kg,其余六組TBARs值仍保持在較低水平(≤0.664 mg/kg)；E、F、G組分別使豬肉TBARs值較A組降低85.7%、89.4%和91.5%,較B、C、D組分別降低了67.7%、46.0%、50.7%。D組最終TBARs值為0.219 mg/kg,E組為0.183 mg/kg,說明添加0.01%的茶多酚微膠囊就能達到添加0.05%茶多酚的脂肪氧化抑制效果,可能是明膠蛋白和殼聚糖通過靜電相互作用增強了芯材的穩定性和生物活性[27],使其脂肪氧化抑制效果更加顯著,以此達到減少茶多酚用量的效果。

表5 不同茶多酚對豬肉TBARs值的影響(mg/kg)

2.3.2 不同茶多酚處理對豬肉風味的PCA分析 主成分分析(PCA)是將傳感器提取的多元因子進行降維、簡化和數據轉換等,提取幾個特征值(能較大程度上反映樣本信息變量的因子)進行線性分類,最后得到可視化的二維散點圖,散點圖上PC1軸和PC2軸包含第一主成分和第二主成分的貢獻率,貢獻率用來反映原始數據信息,貢獻率越大越能最大限度的反映樣本的原本特征[28]。圖4中的每個橢圓代表同批次豬肉風味的數據采集點,PCA分析中第一主成分的方差貢獻率為98.82%,第二主成分的方差貢獻率為0.94%,貢獻率總和達到99.76%,大于95%以上,說明PC1和PC2已經包含足夠的信息量,可以代表樣品揮發性風味的主要特征。因PC1貢獻率遠大于PC2的貢獻率,表明樣品間的差異主要在PC1上,樣品在橫坐標上距離越大,其差異也越大。從主成分PC1和PC2兩個主軸上看,貯藏10 d后空白組(A)的信息采集點的橢圓位于效果圖右邊,與添加茶多酚各處理組無交叉重疊,說明貯藏10 d后的空白組(A)與添加茶多酚各處理組在風味上有較大差別。

圖4 不同茶多酚處理對豬肉風味的PCA分析

表6中數值代表各組區分度大小,其值越接近1區分度越大,說明區分越明顯。B組與E組區分度較差,C組與E、F、G組區分度較差,E組與F、G組區分度較差,與TBARs結果有一定差異。相洋[29]研究了幾種天然保鮮劑對冷鮮豬肉保鮮效果,運用GC-MS對經過處理的冷卻豬肉揮發性組分進行了分析,其結果表明加入保鮮劑后,豬肉中烴類物質、醛類物質和酯類物質含量明顯減少,而其它類物質的含量明顯增加,醇類物質、酮類物質和羧酸類物質變化不大,其原因為添加的天然保鮮劑自身香氣較為濃郁,揮發性成分豐富,對冷卻豬肉含有的部分氣味有所掩蓋。本試驗中可能是除脂肪氧化產生的風味外,添加的不同茶多酚自身攜帶一些味道,脂肪氧化程度較低時,在一定程度上掩蓋了脂肪氧化味,則其風味差異不明顯。雖然D組脂肪氧化指標處于較低水平,但其風味與其余組仍存在較為顯著的差異,可能是因為高濃度的茶多酚添加會嚴重影響豬肉本身的風味,而同處在較高添加量的G組,由于微膠囊包埋掩蓋了茶多酚本身的風味,則在實際應用中能減少對風味的影響。TBARs值測定結果表示A組處于變質肉水平,其余組均處于良質肉水平,脂肪氧化導致肉變質,出現明顯的脂肪氧化味,其電子鼻測定結果與TBARs值結果保持一致,說明電子鼻能較好區分變質肉與良質肉。

表6 不同茶多酚處理豬肉風味PCA分析數據矩陣表

3 結論

利用Design Expert 8.0.6軟件中的D-optional混料設計對自組裝法制備茶多酚-明膠-殼聚糖微粒配方進行優化,得到最優配方為茶多酚含量為0.40、明膠含量為0.50、殼聚糖含量為0.10,其包埋率為為50.87%±0.25%。以得到的最優配方制備得到茶多酚微膠囊在豬肉中按一定比例添加后還能有效抑制脂肪氧化,添加0.01%、0.03%和0.05%的茶多酚微膠囊能分別使豬肉TBARs值較未添加茶多酚的空白組降低85.7%、89.4%和91.5%;分別較添加0.01%、0.03%和0.05%的茶多酚組降低67.7%、46.0%、50.7%；電子鼻測定結果也顯示，添加不同茶多酚處理組的風味與空白組有較大區別，說明得到的茶多酚微膠囊能有效抑制脂肪氧化，延長豬肉的保藏時間。此外，高濃度的茶多酚也會嚴重影響豬肉的風味，因此，將茶多酚微膠囊化，除了能提高茶多酚的穩定性、保持其抗氧化活性外，還能掩蓋其自身的異味，以此可減少其在食品加工中的添加量。