多肽菌素在長牡蠣人工育苗生產中的應用

劉 洋, 趙 強, 于瑞海, 李海昆, 王永旺

多肽菌素在長牡蠣人工育苗生產中的應用

劉 洋1, 趙 強2, 于瑞海1, 李海昆1, 王永旺1

(1. 中國海洋大學, 海水養殖教育部重點實驗室, 山東 青島 266003; 2. 煙臺市海洋經濟發展研究院, 煙臺 364110)

多肽菌素作為一類具有抗菌活性的生物短肽, 是一種可以替代抗生素的生物肽。為了推廣多肽菌素在水產養殖中的應用, 本研究以長牡蠣()人工育苗為基礎, 以添加2×10–6mol/L青霉素鈉為對照組, 以添加5個不同濃度(2×10–6、4×10–6、6×10–6、8×10–6、10×10–6mol/L)多肽菌素為實驗組, 研究多肽菌素在長牡蠣人工育苗生產中的應用。結果顯示: (1)在長牡蠣種貝培育方面, 培育前8天各組差異不顯著(0.05), 培育后期添加6×10–6mol/L多肽菌素組存活率均最高, 對照組最低, 且培育至32天時該實驗組均顯著高于其他組(< 0.05)。(2)在長牡蠣幼蟲培育方面, 幼蟲殼高日增長量在添加6×10–6mol/L多肽菌素組中最大, 為11.57 μm/d, 而對照組僅為9.61 μm/d; 幼蟲存活率方面對照組始終最低, 而添加6×10–6mol/L與8×10–6mol/L多肽菌素組均保持較高存活率, 顯著高于對照組(< 0.05)。(3)在長牡蠣幼蟲附著變態方面, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組附著率最高、附著時間最短, 且均與對照組差異顯著(< 0.05)。(4)在長牡蠣稚貝培育方面, 稚貝殼長日增長量實驗組均高于對照組, 且隨添加濃度的上升, 日增長量也隨之增加; 稚貝存活率在添加6×10–6mol/L多肽菌素組達到最高, 與對照組差異顯著(< 0.05)。結果表明, 使用多肽菌素與使用青霉素鈉相比, 多肽菌素顯著提高了整個牡蠣培育過程中的存活率、生長速度、及附著變態率, 這也為多肽菌素在貝類育苗生產中的推廣提供了基礎依據。

多肽菌素; 長牡蠣; 種貝; 幼蟲; 稚貝

長牡蠣()作為我國重要經濟養殖貝類, 因其生長速度快、產量高、經濟效益顯著等優點, 深受養殖單位喜愛, 近年來隨著牡蠣養殖價格的上漲, 其養殖面積不斷擴大, 帶動了我國牡蠣養殖業的快速發展[1-2], 因此, 對牡蠣苗種需求量也不斷增加, 但近年來, 在牡蠣人工育苗過程中易出現幼蟲下沉死亡、生長緩慢、以及附著變態率低等現象[3-4], 針對這些問題, 育苗單位一般使用抗生素進行抑菌和殺菌等處理, 以降低幼蟲死亡率和提高幼蟲生長及變態率。

抗生素作為控制水產養殖動物疾病發生的重要藥物, 近年來研究表明不僅增加動物耐藥性, 同時藥殘危害水環境中的生態系統, 這使得抗生素漁藥的使用面臨嚴峻挑戰[4-5]。而多肽菌素作為抗菌肽一種, 是一類具有抗菌活性的生物短肽, 廣泛存在于生物界中[6]。該類物質分子量小, 具有熱穩定、水溶性好以及廣譜抗菌等特點, 并且抗菌機理與抗生素完全不同, 不易產生耐藥性[7-8], 是抗菌素的替代品。目前, 關于多肽菌素的應用在水產養殖方面的報道還比較少, 主要集中在對蝦和魚類養殖中, 如Des-tou-mieux等[9]在凡納濱對蝦()中發現抗菌肽在抗菌性能及免疫功能方面優于其他抗菌藥物; 姜珊等[10]研究結果表明, 飼料中添加5~10 mg/kg抗菌肽可以顯著提高羅非魚()的增重率、紅細胞總數以及過氧化氫酶的活性, 張曉宇等[11]對白鰱()也進行過研究, 表明飼料中添加多肽菌素可以提高白鰱的非特異性免疫力和抗病力, 但在貝類育苗和養殖中還未見報道。

本研究以長牡蠣()為研究對象, 以山東深海生物科技股份有限公司提供的多肽菌素為試驗材料, 在牡蠣人工育苗過程中, 通過添加不同濃度多肽菌素研究其對長牡蠣種貝促熟培育、幼蟲及稚貝生長發育的影響, 通過此研究, 旨在替代牡蠣人工育苗中抗菌素的使用, 并以此作為多肽菌素在貝類人工育苗生產中的推廣提供經驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多肽菌素為抗菌肽的一種, 由山東深海生物科技股份有限公司提供, 原名多肽菌素S100。主要成分為抗菌多肽APSH-07、機體防御肽DPS-01、組織修復肽、益生素等, 外觀為褐色液體, 有酵香氣味。

1.2 實驗地點

實驗于2018年夏季至2019年春季在萊州市樂平水產科技有限公司育苗場進行, 實驗用育苗池大小為4 m×5 m×1.2 m, 實驗期間水溫為23 ~ 24℃, 鹽度為29。

1.3 實驗設計

種貝培育期隨機選取400個長牡蠣, 分為1個對照組和3個實驗組, 每組100個。幼蟲培育期取剛孵化完的D形幼蟲均分為18個培育池, 分為1個對照組, 5個實驗組, 每組設三個重復。稚貝培育期分組同幼蟲培育期, 見表1。

表1 實驗期間不同培育期的處理濃度

注: 圖中字母代表處理濃度。對照組: A (2×10–6mol/L); 實驗組: a1 (2×10–6mol/L), a2 (4×10–6mol/L), a3 (6×10–6mol/L), a4 (8×10–6mol/L), a5 (10×10–6mol/L)

1.4 種貝及幼蟲的培育管理

添加劑每天換水后均勻潑灑, 種貝餌料以小新月菱形藻()為主, 亞心形扁藻()為輔; 幼蟲餌料以球等邊金藻()為主, 小球藻()為輔, 后期投喂亞心形扁藻。每天觀測生長存活狀況, 并記錄數據。

1.5 取樣及數據計算

取樣時為保證數據準確性采用三點取樣法, 即培育池的前中后位置。幼蟲期采用500 mL燒杯迅速取樣, 顯微鏡下觀察并記錄幼蟲大小及幼蟲數量; 附著期采用同樣方法測量培育池中幼蟲密度計算附著率; 稚貝期通過隨機抽取附著基, 觀察并記錄稚貝大小及數量。種貝存活率為測量時存活個數與初始個數之比; 幼蟲殼高平均日增長量為第22天測量時幼蟲平均殼高與初始殼高的差值與培育天數的比值; 幼蟲存活率為測量時幼蟲密度與初始密度之比; 附著率為第7天測量時已附著稚貝數量與初始幼蟲數之比; 稚貝存活率及殼長平均日增長量同幼蟲培育期計算, 出庫時間以稚貝達到出庫規格時間為準。

1.6 數據分析

實驗數據均采用平均值±標準差 (Mean±SD) 表示, 采用SPSS23.0進行數據分析。各個實驗均采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 顯著水平均設為< 0.05。

2 結果

2.1 多肽菌素對長牡蠣親貝存活及產卵孵化的影響

實驗期間長牡蠣種貝存活率情況見圖1。培育前8天, 各組存活率均差異不顯著(> 0.05); 培育至第14天, 各實驗組均顯著高于對照組(< 0.05), 且添加6×10–6mol/L多肽菌素組存活率達到最高; 培育至第32天, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組仍為最高達到(83.67 ± 2.17) %, 且與其他各組均差異顯著(< 0.05), 而此時對照組存活率僅為(70.23 ± 2.17) %。

圖1 不同處理濃度下長牡蠣種貝存活情況

注: 相同培育時間下不同字母間表示差異顯著(< 0.05)

實驗期間種貝產卵及孵化情況見表2。將存活親貝進行刺激產卵, 發現產卵量在添加6×10–6mol/L多肽菌素組最大, 由于種貝數目不同, 性別比不同, 故不能由此判定最適濃度。在受精率方面, 各組間差異不顯著(> 0.05), 添加6×10–6mol/L及10×10–6mol/L多肽菌素組受精率較高; 但在孵化率方面, 添加6× 10–6mol/L多肽菌素組達到最高, 且與對照組差異顯著。

2.2 多肽菌素對長牡蠣幼蟲生長發育的影響

添加多肽菌素對長牡蠣幼蟲殼高生長具有顯著影響(< 0.05)(見表3)。培育至第2天, 各組間差異不顯著(> 0.05)。隨日齡增加幼蟲規格逐漸增大, 最適培育條件逐步發生變化。培育第6天至22天, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組平均殼高均最大, 且顯著高于其它組(< 0.05)。培育至第14天、18天、22天, 添加8×10–6mol/L多肽菌素組平均殼高僅次于添加6×10–6mol/L多肽菌素組, 且顯著高于其他組(< 0.05)。培育至第22天時, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組平均殼高比對照組高(40.27 ± 2.51) μm。

實驗期間長牡蠣幼蟲殼高平均日增長量如圖2所示。添加6×10–6mol/L多肽菌素組殼高平均日增長量最高, 達到(11.57 ± 1.24) μm/d, 與添加8×10–6mol/L多肽菌素組差異不顯著(> 0.05), 與其他各組均差異顯著(< 0.05)。除添加6×10–6mol/L多肽菌素組之外各組均差異不顯著(> 0.05), 對照組殼高平均日增長量最低為(9.61 ± 1.67) μm/d。

表2 不同處理濃度下種貝產卵量及受精孵化情況

注: 同一行數據標注不同上標字母代表差異顯著(<0.05)

表3 不同處理濃度下長牡蠣幼蟲的殼高生長情況/μm

注: 同一列數據標注不同上標字母代表差異顯著(<0.05)

實驗期間長牡蠣幼蟲存活情況如圖3所示。第2天各組間存活率相差較小, 第2天之后添加6× 10–6mol/L與8×10–6mol/L多肽菌素組長牡蠣幼蟲存活率較高, 兩組之間差異不顯著(> 0.05), 但始終顯著高于其他各組(< 0.05)。培育期間, 前10天各組存活率下降較快, 之后趨于平緩。培育至第22天, 對照組存活率僅為(34.46 ± 1.63) %, 而添加多肽菌素6×10–6mol/L與8×10–6mol/L多肽菌素組存活率分別為(58.25 ± 0.73) %, (55.49 ± 1.24) %。

2.3 多肽菌素對長牡蠣幼蟲附著變態的影響

當眼點幼蟲達到50%~60%時投放附著基, 第7天測量附著率。實驗期間長牡蠣幼蟲附著情況如圖4所示。在附著率方面, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組最高, 為(57.68 ± 1.27) %, 且與各組差異顯著(< 0.05)。各實驗組除添加2×10–6mol/L多肽菌素組外均顯著高于對照組(< 0.05), 且添加6×10–6mol/L、8×10–6mol/L、10×10–6mol/L多肽菌素組附著率均高于50 %, 而對照組僅為(37.23 ± 2.03) %。在附著時間方面, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組附著時間最短, 僅為(123.33 ± 0.89) h, 與添加8×10–6mol/L多肽菌素組差異不顯著(> 0.05), 與其他組差異顯著(< 0.05)。而對照組附著時間為(171.67 ± 1.24) h, 比添加10×10–6mol/L多肽菌素組長近50 h。

圖2 不同處理濃度下長牡蠣幼蟲殼高平均日增長量

注: 不同字母間表示差異顯著(< 0.05)

圖3 不同處理濃度下長牡蠣幼蟲存活情況

圖4 不同處理濃度下長牡蠣幼蟲附著情況

2.4 多肽菌素對長牡蠣稚貝生長發育的影響

自90 %以上眼點幼蟲完成附著變態至培育至稚貝(平均500 μm以上)出庫, 這一階段稱為稚貝培育階段, 一般8~10天。此階段稚貝生長情況直接影響苗量高低, 通過添加不同濃度多肽菌素以提高出苗量, 實驗結果如圖5、圖6所示。在稚貝殼長日增長量方面, 實驗組均高于對照組, 且隨著多肽菌素濃度的上升, 日增長量也隨之增加, 添加10×10–6mol/L多肽菌素組達到最高, 為(32.09 ± 1.18) μm/d, 除與添加6×10–6mol/L、8×10–6mol/L多肽菌素組差異不顯著外(> 0.05), 與其他各實驗組均差異顯著(< 0.05)。對照組殼高平均日增長量僅為(18.33 ± 2.19) μm/d, 顯著低于各實驗組(< 0.05)。在稚貝存活率方面, 添加6×10–6mol/L多肽菌素組最高, 存活率高達(84.29 ± 1.47) %, 添加8×10–6mol/L多肽菌素組次之, 為(80.17 ± 2.13) %, 而對照組僅為(62.48 ± 1.67) %。

圖5 不同處理濃度下長牡蠣稚貝殼長平均日增長量

注: 不同字母間表示差異顯著(< 0.05)

圖6 不同處理濃度下長牡蠣稚貝存活情況

注: 不同字母間表示差異顯著(< 0.05)

圖7 不同處理濃度下長牡蠣稚貝出庫時間情況

注: 不同字母間表示差異顯著(< 0.05)

不同處理濃度下長牡蠣稚貝出庫時間情況如圖7所示。添加6×10–6mol/L多肽菌素組出庫時間最短為(155.67 ± 3.23) h, 約為6天半, 且該組除與添加8×10–6mol/L多肽菌素組出庫時間差異不顯著(> 0.05)外, 與其他各組均差異顯著(< 0.05)。對照組出庫時間最長為(201.43 ± 2.84) h, 約為8天半, 除與添加2×10–6mol/L多肽菌素組差異不顯著(> 0.05), 均顯著低于另外4個實驗組(< 0.05)。對照組與添加6× 10–6mol/L多肽菌素組出庫時間相差近2天, 若多肽菌素廣泛應用于貝類育苗, 這將大大提高人工育苗效率。

3 討論

3.1 多肽菌素作用機理及其在水產養殖中的應用現狀

多肽菌素作為抗菌肽的一種, 具有獨特的抗菌機制, 可以快速的殺死病原體, 包括細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒以及寄生蟲等, 并且毒副作用小, 不易產生耐藥性, 可以替代抗生素, 符合水產品安全生產的需要, 已成為國內外研究和開發的熱點[12-13]。目前關于抗菌肽的作用機理有兩種說法, 一是抗菌肽直接作用于細胞膜改變滲透性, 二是作用于細胞內靶點[14]。作用于細胞膜是由于抗菌肽表面帶正電, 而革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌表面帶負電荷, 兩者間會互相吸引, 相互作用, 導致細菌表面的Mg2+或Ca2+被替換, 使細胞滲透壓失常, 細胞質外泄, 從而導致細胞死亡, 并且膜作用機制有多種, 包括桶板模式、地毯模式、環孔模式[15-17]。對于膜內作用, 有研究表示抗菌肽通過穿透細胞膜在細胞質中蓄積并與DNA和RNA相互結合, 從而導致細胞死亡[18]; 抗菌肽麻蠅素－Ⅱ能夠有效抑制細菌細胞壁或者其他隔膜形成, 導致細菌生長受阻[19], 從而導致細胞死亡。

多肽菌素在水產養殖中的應用相對較少, 主要集中在以下幾個方面。第一, 抗菌肽抑制水產養殖中常見病原菌, 降低水體中病原菌的數量, 從而有效提高水產養殖動物的存活率[12]; 第二, 抗菌肽可以提高水產養殖動物的生產性能, 改善腸道消化功能, 主要表現在養殖動物的增重率、餌料系數以及生長率等指標上[20]; 第三, 抗菌肽可以增強水產動物的免疫性能, 大量研究認為, 抗菌肽是通過調節某些生長因子與其受體的表達, 激活機體相關信號通路, 充當單核細胞和中性粒細胞等免疫細胞的趨化因子[21],與動物非特異性免疫協同作用, 來增強機體的免疫力, 從而對機體起到保護作用。目前抗菌肽作用機制雖未完全研究透徹, 但抗菌肽在提高動物生長性能方面已被證實, 所以抗菌肽在水產行業具有極大的應用空間和廣闊的發展前景。

3.2 多肽菌素在長牡蠣人工育苗生產中影響討論

本研究表明多肽菌素能夠顯著提高長牡蠣人工育苗生產效率。在種貝實驗過程中, 培育至后期各實驗組存活率均顯著高于對照組(< 0.05), 且在種貝產卵孵化期間, 各實驗組孵化率均高于對照組。這一結果與Tassanakajon等[22]對凡納濱對蝦研究結果相似, 當在飼料中添加2 000~3 000 mg/kg的抗菌肽時, 凡納濱對蝦的成活率、增重率、特定生長率以及飼料效率均顯著高于未添加組; 同樣的結果在凡納濱對蝦研究中, 覃志彪等[23]表明在飼料中添加5 000~ 8 000 mg/kg天蠶素抗菌肽, 可以提高對蝦成活率, 并且提高對蝦的營養成分。另外在黃滄海等[24]在對羅非魚的研究中發現, 添加抗菌肽組在促進羅非魚增重方面極顯著高于抗生素組, 并且提高了羅非魚的肥滿度。這可能是多肽菌素S100在種貝腸道內發揮作用, 促進有益菌、抑制有害菌的生長, 使得種貝存活率上升。

在長牡蠣幼蟲培育過程中, 實驗表明添加多肽菌素存活率以及平均日增長量均高于青霉素鈉組, 青霉素鈉組始終最低, 同樣在在幼蟲附著階段也顯示添加多肽菌素附著率高于未添加組, 且附著時間短。另外在幼蟲培育過程中得出多肽菌素最適添加濃度為6×10–6mol/L, 當高于該濃度時, 幼蟲存活及生長均出現下降趨勢。這些實驗結果可能是因為適宜濃度多肽菌素能夠促進幼蟲的生長發育, 提高餌料利用率, 濃度過高反而會抑制幼蟲的生長。因為抗菌肽能夠維持腸道內生態平衡, 如果長時間攝食高濃度抗菌肽可能會抑制腸道內有益菌, 導致幼蟲生長變慢甚至死亡。類似的實驗結果在王四新等[25]對草魚()的研究中表明飼料中添加抗菌肽可以顯著提高草魚的增質量速度和相對增重率; 在王自蕊等[26]對湘云鯽()的研究中證明添加150和200 mg/kg的天蠶素抗菌肽對湘云鯽有促生長效果; 另外在最適添加量研究中, 林鑫等[27]和賈滔等[28]在鯉魚()的飼料中添加100~200 mg/kg抗菌肽, 鯉魚的特定生長率與增重率顯著提高, 最佳添加水平為150 mg/kg; 鄭宗林等[29]在對紅姑娘魚()的研究中, 發現300 mg/kg 組與500 mg/kg組在增重率、飼料效率和蛋白效率都顯著高于對照組, 最適添加量為300 mg/kg,可顯著提高紅姑娘魚的增重率與飼料轉化率。這些研究結果均表明抗菌肽能有效促進水產動物的生長發育, 但最適添加量因不同物種而異, 可能是由于抗菌肽在不同物種體內的作用機制與作用途徑不同, 還有待研究。

在長牡蠣稚貝培育階段, 添加多肽菌素稚貝存活率顯著提高且生長速度快, 另外出庫時間縮短近2天。稚貝階段個體小, 缺乏特異的免疫系統, 主要依靠天然免疫保護機體免受外界病原的危害[30]。在劉翠玲等[31]研究中發現, 飼料中添加3 g/kg抗菌肽生物制劑可以促進鯉魚幼魚的生長與消化; 何義進等[32]通過在異育銀鯽()飼料中添加0.2%以上抗菌肽, 結果表明提高了血清中超氧化物歧化酶活性, 改善了機體免疫能力。所以在稚貝培育過程中添加多肽菌素可以提高稚貝的免疫能力, 當機體受到外界攻擊時, 抗菌肽起到調節、防御免疫作用, 從而使得稚貝存活率升高并且生長速度加快, 從而達到提高人工育苗效率的目的。

4 結果

本實驗中, 通過在育苗池中添加不同濃度多肽菌素, 研究出有利于長牡蠣人工育苗生產的最佳濃度為6×10–6mol/L。實驗表明多肽菌素具有較好的抗菌性, 可替代抗菌素使用, 對于貝類的抗病能力及成活率的提高具有顯著效果。目前多肽菌素作用機制尚未完全研究透徹, 但為水產育苗、養殖中病害防治的應用奠定了基礎。

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Application of polypeptide fungicin in the artificial seedling production of Pacific oyster ()

LIU Yang1, ZHAO Qiang2, YU Rui-hai1, LI Hai-kun1, WANG Yong-wang1

(1. Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao, Shandong, 266003; 2. Yantai Fisheries Research Institute, Yantai 364110, China)

Polypeptide fungicin is a type of biopeptide that possesses antibacterial activity and can replace antibiotics. To promote the application of polypeptide fungicin in aquaculture, this study aimed to determine its application in the artificial seedling production of Pacific oysters ()This study is based on the artificial seedling production of; penicillin sodium was employed (2×10?6mol/L) as the control group, and five different concentrations of polypeptide fungicin (2×10?6, 4×10?6, 6×10?6, 8×10?6, and 10×10?6mol/L) were employed as the experimental group. The results of this study are summarized as follows. First, there was no significant difference between each group 8 days before cultivation of thescallop (> 0.05). The experimental group with 6×10?6mol/L polypeptide fungicin at the later stage of cultivation had the highest survival rate, whereas the control group had the lowest survival rate. The survival rate of the experimental group with 6× 10?6mol/L polypeptide fungicin was significantly higher than that of the other groups at 32 days of cultivation (< 0.05). Second, in terms oflarvae, the increase in larval shell height in the experimental group with 6×10?6mol/L polypeptide fungicin was 11.57 microns per day, whereas that in the control group was only 9.61 microns per day. The control group had the lowest larval survival rate; a significantly higher survival rate was maintained in the experimental group with 6×10?6and 8×10?6mol/L polypeptide fungicin than in the control group (< 0.05). Third, in terms of the attachment metamorphosis oflarvae, the attachment rate of the experimental group with 6×10?6mol/L polypeptide fungicin was the highest along with the shortest attachment time, which were significantly different from the control group (< 0.05). Fourth, in the cultivation of the juvenile(oysters), the daily growth amount of juveniles in the experimental group was higher than that in the control group. In addition, the increase in concentration of polypeptide fungicin led to an increase in the daily growth amount. The survival rate of juveniles was highest in the experimental group with 6×10?6mol/L polypeptide fungicin, which was significantly different from the control group (< 0.05). The results showed that compared with the use of penicillin sodium, the use of polypeptide fungicin considerably improved the survival rate, growth rate, and adhesion conversion rate during the entire oyster cultivation process. In addition, it improved the efficiency of artificial oyster seedlings, which provides a basis for the promotion of polypeptide fungicin in the production of shellfish seedlings.

polypeptide fungicin;; scallop; larvae; juvenile

Nov. 11, 2019

[This work was supported by Marine Economy Innovation and Development Regional Demonstration project, No. 12PYY001SF08-ZGHYDH-1;National Laboratory Project, No. 201ASKJ02-0]

S985

A

1000-3096(2020)04-0059-08

10.11759/hykx20191111001

2019-11-11;

2019-12-28

海洋經濟創新發展區域示范專項(12PYY001SF08-ZGHYDH-1); 國家實驗室項目(201ASKJ02-0)

劉洋(1996-), 男, 山東省泰安人, 碩士生, 研究方向: 貝類繁育及育種, 聯系電話: 17854223149, E-mail: 1447863885@ qq.com; 于瑞海,

, 男(1964-), 教授級高工, 貝類繁育及育種研究, E-mail: yuruihai@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛紅)