RP-HPLC法同時測定翅堿蓬中四種黃酮化合物的含量

郭麗霞, 寧寰宇, 曹 葦, 李 慧, 孔 亮, 譚成玉

RP-HPLC法同時測定翅堿蓬中四種黃酮化合物的含量

郭麗霞, 寧寰宇, 曹 葦, 李 慧, 孔 亮, 譚成玉

(大連海洋大學 海洋科技與環境學院, 遼寧 大連 116023)

建立RP-HPLC(反相高效液相色譜法)同時測定翅堿蓬中四種黃酮化合物-蕓香苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的含量。采用Kromasil C18色譜柱( 4.6 mm × 250 mm, 5 μm) , 檢測波長為361 nm, 柱溫為30℃, 流動相為甲醇-0.4%冰乙酸(55︰45), 流速1.0 mL/min, 四種黃酮類化合物得到很好的分離。蕓香苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素濃度均為0.001~0.01 mg/mL范圍內呈現良好線性關系, 相關系數2在0.999 0~0.999 6, 加標回收率(=3)范圍為82.39%~99.03%。該方法簡單、快速、高效, 可以用于翅堿蓬中四種黃酮化合物的含量分析。

翅堿蓬; 反相高效液相色譜; 蕓香苷; 槲皮素3-β-D-葡萄糖苷; 水仙苷; 槲皮素

翅堿蓬(Kitag.), 亦稱黃蓿菜、黃須菜、鹽地堿蓬等, 為被子植物藜科(Cheno-podiaceae)堿蓬屬()的一年生鹽生植物, 也是一種典型的鹽堿指示植物?，F代醫學研究表明, 堿蓬屬植物具有降血糖、降血壓、保護心臟、增強免疫等作用[1-2]。目前對該屬植物研究較多的為生理生長及耐鹽方面[3-4], 而對其化學成分的研究報道較少, 主要含有黃酮類化合物[5-7]、脂肪酸類、萜類、多酚類[8]以及脂類[9]等活性成分, 包括具有較好生物活性的黃酮類化合物蕓香苷、水仙苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素等。

近幾年, 濱海濕地的翅堿蓬呈現明顯的退化趨勢, 每年都有大面積的翅堿蓬非自然性死亡, 甚至很多地方都已經變為了灘涂, 對當地的濕地功能和生態旅游價值造成了極大影響。趙肖依[10]、何潔等[11]研究了外界條件——鹽度、銅離子及農藥脅迫對翅堿蓬發芽率和生長的影響, 本文通過建立RP-HPLC對翅堿蓬黃酮類化合物的含量分析方法, 對盤錦濱海濕地的翅堿蓬植株樣本中的黃酮類化合物含量進行測定, 為分析翅堿蓬退化原因及充分利用翅堿蓬植物的藥用價值提供一定的理論參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀Waters 600(Waters 2487雙波長檢測器, Empower工作站), Kromasil C18(大連中匯達科學儀器有限公司), 旋轉蒸發儀RE201C(上海亞榮生化儀器廠), 閃式提取器JHBE-50T(河南金鼐科技發展有限公司), 紫外-可見光分光光度儀Lambda 35(Perkin Elmer), 電子分析天平AB104-N(梅特勒-托利多儀器公司), 超聲波清洗器SB-5200D(寧波新芝生物科技有限公司), 超純水凈化儀CM-230(帕恩特公司)。

1.2 試藥

翅堿蓬()植株, 于2018年10月在遼寧盤錦紅海灘濕地的接官廳(40°54′01.21″N, 121°49′33.16″E)、廊橋愛夢(40°48′42.21″N, 121°52′45.71″E)、小島閑情(40°51′48.53″N, 121°49′59.12″E)、依水云舟(40°55′11.80″N, 121°55′34.92″E)四個景觀點采集, 經粉碎、過篩待用。標準品蕓香苷和槲皮素為本實驗室從槐米中分離純化、精制得到(純度98%), 標準品槲皮素3-β-D葡萄糖苷和水仙苷購于阿拉丁(上海)有限公司。所用甲醇為色譜純, 其余試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 溶液制備

2.1.1 標準品儲備液

精密稱取蕓香苷、槲皮素-3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素各2.5 mg, 分別置于4個小燒杯中加適量甲醇溶解, 移入容量瓶, 并定容至刻度, 搖勻, 制成含上述四種黃酮標準品儲備溶液。各取上述儲備液5 mL, 混勻, 制得四種黃酮混合溶液。

2.1.2 供試品溶液

精密稱取四個不同采樣點的翅堿蓬植株各5 g, 加入250 mL甲醇進行閃式破碎提取5 min, 70℃下水浴加熱1.5 h, 回流兩次, 傾出上清液, 用四層紗布過濾, 獲得翅堿蓬提取液, 搖勻, 0.45mm有機針式濾膜過濾, 取濾過液為供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱: Kromasil C18(I.D. 4.6×250 mm, 5 μm), 流動相: 甲醇-0.4%冰乙酸(55︰45), 流速: 1 mL/min, 檢測波長: 361 nm, 柱溫: 30℃, 進樣量: 20 μL。在此色譜條件下, 四種黃酮化合物——蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的色譜峰得以較好分離, 其色譜圖見圖1a。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性回歸分析

分別吸取如2.1.1中配制的四種黃酮混合儲備液適量, 置于容量瓶中, 色譜級甲醇稀釋至刻度線, 搖勻, 濾膜過濾, 制得蕓香苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素濃度均為0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL的標準混合溶液。

圖1 標準品(a)及樣品(b)的HPLC譜圖

注: 1: 蕓香苷; 2: 槲皮素-3-β-D葡萄糖苷; 3: 水仙苷; 4: 槲皮素

按照上述的色譜條件進樣檢測分析, 以四種黃酮化合物的質量濃度()為橫坐標, 吸收峰面積()為縱坐標, 分別繪制四種黃酮化合物的標準曲線, 得到線性回歸方程(見表1), 可以看出四種黃酮化合物在濃度為0.001~0.01 mg/mL時呈現良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗

分別精密吸取2.3.1中同一標準混合溶液20mL, 在2.2色譜條件下連續進樣6次, 通過峰面積6次積分, 求得蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素各峰面積的RSD值分別為3.54%、2.69%、2.20%、3.37%, 表明該條件下色譜儀器的精密度良好。

表1 峰面積與濃度的線性關系

2.3.3 重現性試驗

平行制備6份供試樣品的溶液, 在2.2色譜條件下連續進樣6次, 測定供試品中蕓香苷、槲皮素-3- β-D-葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素峰面積積分值, 外標法計算其含量。通過計算得出蕓香苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素的RSD分別為3.48%、4.23%、3.85%、1.55%, 表明該檢測方法重現性良好。

2.3.4 穩定性試驗

分別在0、3、6、9、12、24、48小時精密吸取同一供試品溶液進行分析。記錄峰面積, 并計算出蕓香苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素的RSD值, 依次為2.34%、3.80%、4.04%、3.96%。表明供試品溶液在制備后的48 h內穩定性良好。

2.3.5 最低檢測限試驗

用色譜純甲醇逐級稀釋濃度均為0.001 mg/mL的蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的混合標準品溶液, 逐一注入HPLC中進行檢測, 記錄色譜峰, 以到樣品峰響應信號為噪聲3倍(S/N≈3)時作為最小可檢測信號, 此時的進樣量為樣品的最低檢測限, 記錄四種黃酮化合物的最低檢測限度。實驗結果顯示, 蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素標準品的最低檢測限分別為0.28、6.7、0.57、1.4mg。

2.3.6 加樣回收率實驗

取同一景觀采樣點翅堿蓬植株9份, 各約0.5 g, 分別向其中加入高、中、低三個水平的蕓香苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、槲皮素), 依照2.1.2項下進行提取, 獲得供試液。將得到的9份濾液供試品, 按照2.2色譜條件, 測得峰面積, 計算四種黃酮化合物的平均回收率和RSD值(見表2)。

表2 加樣回收率實驗結果

2.4 樣品含量測定

精密吸取2.1.2下的供試品溶液各20mL, 按2.2項下的色譜條件進樣測定樣品中四種黃酮峰面積的積分值, 外標法測定其含量, 色譜圖見圖1b, 計算結果見表3。根據表3可以得出, 翅堿蓬中的蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的含量在不同的采樣點各有不同, 有的甚至差異極大。其中, 廊橋愛夢、小島閑情兩個采樣點的翅堿蓬中四種黃酮化合物的含量均較高, 而接官廳和依水云舟兩處的翅堿蓬植株中黃酮類成分的含量較少, 這與采集的翅堿蓬植株的新鮮度有一定關系。

表3 四個采樣點的四種黃酮化合物的含量

3 討論

黃酮類化合物具有抗氧化性、抗腫瘤、抗肝炎病毒、消炎、解痙、抑菌、抑制異常的毛細血管通透性增加及阻力下降、增加冠脈流量、擴張冠狀動脈、影響血壓、改善微循環、改變體內酶活性等重要生物活性[5, 12-15]。濱海濕地植物翅堿蓬中富含黃酮類化合物, 本實驗建立了RP-HPLC法定量分析翅堿蓬樣品中的蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的含量。在選擇檢測波長時, 采用紫外-可見光分光光度計在200~700 nm波長掃描, 確定361 nm為其最大吸收波長。另外, 在配制流動相中向甲醇-水體系加入一定量的冰乙酸[16], 主要是考慮四種黃酮化合物在結構上存在較多的酚羥基, 具有一定的酸性, 故加入一定量的冰乙酸可以減小色譜峰的拖尾; 因此本實驗中選擇Kromasil C18色譜柱, 甲醇-0.4%冰醋酸(55︰45)為流動相, 出峰時間控制在20 min以內, 色譜峰峰形較好, 蕓香苷、槲皮素3-β-D葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素在此條件下能與樣品中其他雜質峰有效分離。

本文實驗中廊橋愛夢和小島閑情兩個采樣點采到的翅堿蓬植株新鮮, 呈紫紅色; 接官廳和依水云舟兩處采集的植株干枯, 為深褐色。實驗結果顯示采樣點不同, 新鮮程度不同, 翅堿蓬中四種黃酮化合物的含量差異較大, 翅堿蓬越鮮活, 黃酮化合物含量越高, 這也為濱海濕地植物翅堿蓬的退化作用機制研究提供一定的思路, 是否考慮后續設計實驗, 在翅堿蓬植株生長的重要時期, 噴灑一定濃度的黃酮類化合物, 來看是否對翅堿蓬植株的生長有一定作用, 是否會對翅堿蓬的正常生長具有一定的促進作用及能否在一定程度上降低翅堿蓬種群的退化。

4 結論

建立了簡單、快速、高效的RP-HPLC法同時測定翅堿蓬中四種黃酮化合物-蕓香苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷、水仙苷和槲皮素的含量。使用Kromasil C18色譜柱, 在檢測波長361 nm, 柱溫30°C, 流動相為甲醇-0.4%冰乙酸(55:45), 流速1.0 mL/min的條件下, 四種黃酮類化合物得到很好的分離。在此條件下對采自遼寧盤錦紅海灘濕地四個景觀點的翅堿蓬植株體內四種黃酮類化合物進行了含量分析, 發現植株越鮮活, 其中的黃酮化合物含量越高。本實驗亦可以為翅堿蓬中黃酮類化合物的后續研究與應用提供一定的科學參考。

[1] 丁海榮, 洪立洲, 楊智青, 等. 鹽生植物堿蓬及其研究進展[J]. 江西農業學報, 2008, 20 (8): 35-37. Ding Hairong, Hong Lizhou, Yang Zhiqing, et al. Progress of Study on Halophyte[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2008, 20(8): 35-37.

[2] 王瑞軒, 李峰, 郭麗霞, 等. 濱海濕地植物翅堿蓬總黃酮的制備及其抑制ACE活性研究[J]. 精細與專用化學品, 2019, 27(3): 9-12. Wang Ruixuan, Li Feng, Guo Lixia, et al. Preparation on the total flavonoids fromand its ACE inhibitory activity[J]. Fine and Specialty Chemicals, 2019, 27(3): 9-12.

[3] Song Jie, Fan Hai, Zhao Yuanyuan, et al. Effect of salinity on germination, seedling emergence, seedling growth and ion accumulation of a euhalophytein an intertidal zone and on saline inlind[J]. Aquatic Botany, 2008, 88: 331-337.

[4] Qi Cuihua, Chen Min, Song Jie, et al. Increase in aqua-porin activity is involved in leaf succulence of the euha-lophyteunder salinity[J]. Plant Science, 2009, 176: 200-205.

[5] 高健. 鹽地堿蓬中黃酮類物質的提取及抗氧化性研究[J]. 鹽城工學院學報, 2005, 18(2): 55-57. Gao Jian. A Study of the Extraction of Flavonoids and in[J]. Journal of Yancheng Institute of Te-chnology (Natural Science), 2005, 18(2): 55-57.

[6] 張澤生, 王麗, 楊建波, 等. 鹽地堿蓬的化學成分研究[J]. 天然產物研究與開發, 2012, 24(6): 775-776. Zhang Zesheng, Wang Li, Yang Jianbo, et al. Chemical Constitutes of[J]. Natural Product Research and Development, 2012, 24(6): 775-776.

[7] Men R Z, Li N, Xing Y C, et al. Chemical constituents and ACE inhibitory activity of desert plantPall[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2013, 3(5): 328-332.

[8] 胡博路, 杭瑚. 翅堿蓬的抗氧化活性研究[J]. 中國海洋藥物, 2001, (4): 29-31. Hu Bolu, Hang Hu, Study on the antioxidative effects ofKitag.[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2001, (4): 29-31.

[9] 陳然然, 邵榮, 楊劍, 等. 堿蓬籽油脂的超臨界CO2提取工藝優化[J], 化學工程師, 2015, 232(1): 61-64, 71. Chen Ranran, Shao Rong, Yang Jian, et al. Optimization of supercritical CO2extraction of oils and fats from suaeda salsa seed[J]. Chemical Engineer, 2015, 232(1): 61-64, 71.

[10] 趙肖依, 魏海峰, 胡蝶, 等. 鹽度、銅離子及草甘膦對翅堿蓬發芽率和生長的影響[J], 大連海洋大學學報, 2019, 2: 185-190. Zhao Xiaoyi, Wei Haifeng, Hu Die, et al. Effects of salinity, and concentrations of copper ions and glyphosate on germination and growth rates of saline seepweed[J]. Journal of Dalian Ocean University, 2019, 2: 185-190.

[11] 何潔, 何曉彤, 劉遠, 等. 丁草胺和馬拉硫磷對翅堿蓬生長及抗氧化酶系統的影響[J]. 大連海洋大學學報, 2016, 5: 511-558. He Jie, He Xiaotong, Liu Yuan, et al. Effect of butachlor and malathion on growth and antioxidant enzyme system in common seepweed herb[J]. Journal of Dalian Ocean University, 2016, 5: 511-558.

[12] 石雪萍, 余芳. RP-HPLC測定小茴香中槲皮素和山奈酚含量[J]. 中國調味品, 2015, 40(5): 93-96. Shi Xueping, Yu Fang. Determination of quercetin and kaempferol in Foeniculum vulgare Mill. by RP-HPLC[J]. China Condiment, 2015, 40(5): 93-96.

[13] 王洪彪, 王鵬輝, 秦嘉駒, 等. 植物黃酮類化合物的提純和含量測定方法研究概況[J]. 吉林化工學院學報, 2018, 35(7): 44-47. Wang Hongbiao, Wang Penghui, Qin Jiaju, et al. Research Profile of the extraction, purification and determination of flavonoids in plants[J]. Journal of Jilin Institute of Chemical Technology, 2018, 35(7): 44-47.

[14] 趙學思, 師仁麗, 李巖, 等. 堿蓬黃酮提取物的體外抗氧化及抑菌性研究[J]. 食品工業科技, 2016, 37(13): 1-10. Zhao Xuesi, Shi Renli, Li Yan, et al. Antioxidation and antibacterial property of flavonoids compounds extracted from[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(13): 1-10.

[15] 張澤生, 王婷婷, 韓順凱, 等. 鹽地堿蓬提取物對高脂血癥倉鼠血脂的影響[J]. 食品科技, 2012, (12): 227- 230. Zhang Zesheng, Wang Tingting, Han Shunkan, et al. Effect of Suaeda salsa extracts on blood lipid in hyperlipemia hamsters[J]. Food Science and Technology, 2012, (12): 227-230.

[16] 波拉提·馬卡比力, 孟繁桐, 孔亮, 等. RP-HPLC同時測定全緣葉藍刺頭地上部分兩種黃酮醇[J]. 中國藥學雜志, 2018, 53(2): 136-139. Makabel Bolat, Meng Fantong, Kong Liang, et al. Simultaneous determination of contents of two flavonols in the aerial parts ofby RP-HPLC[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2018, 53(2): 136-139.

Simultaneous determination of four flavonoids inby RP-HPLC

GUO Li-xia, NING Huan-yu, CAO Wei, LI Hui, KONG Liang, TAN Cheng-yu

(College of Marine Science and Environment, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

In this study, we established a reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the simultaneous determination of four flavonoids—rutin, quercetin 3-β-D-glucoside, narcissoside, and quercetin—in. The separation was achieved using a Kromasil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) at 30℃, with methanol-0.4% glacial acetic acid (55︰45) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL.min–1and a detection wavelength of 361 nm. The correlation coefficients ranged between 0.999 0 and 0.999 6 with calibration curves in the range of 0.001–0.01 mg·mL–1for the four flavones. The average recoveries (= 9) obtained were 82.39%–99.03%. This method is simple, rapid, and efficient, and can be used for the simultaneous determination of rutin, quercetin 3-β-D glucoside, narcissoside, and quercetin insamples.

; RP-HPLC; flavonoids; rutin; quercetin 3-β-D-glucoside; narcissoside; quercetin

Jul. 16, 2019

[The Key Project of Natural Fund of Liaoning Province, No. 20170540102; The Wetland Degradation and Restoration Programof Panjin Pink Beach, No. PHL-XZ-2017013002]

O629.9

A

1000-3096(2020)04-0111-05

10.11759/hykx20190716003

2019-07-16;

2019-10-06

遼寧省自然科學基金重點項目(20170540102), 盤錦紅海灘濕地退化與生態修復項目(PHL-XZ-2017013002)

譚成玉,

, 博士, 教授, 碩士生導師, 電話: 0411-84763520, E-mail: tanchyu@dlou.edu.cn

(本文編輯: 楊 悅)