響應面法優化蘋果醋醋酸發酵工藝

劉光鵬，初樂，朱風濤，張鑫，孫苗苗，高玲，趙巖*

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014；2.綠杰股份有限公司，山東龍口 265718）

我國的蘋果種植面積和產量均高居世界首位，但蘋果的加工總量不足產量的20%，且加工形式以果汁加工為主[1]。蘋果醋是以蘋果汁為原料經微生物發酵而成的一種健康飲品，含有多種對人體有益的營養和功能成分，具備水果和食醋的雙重保健功效[2-4]，而且蘋果醋還可以作為調味品使用。我國目前市場上蘋果醋產品大多以蘋果濃縮汁為原料，更有甚者采用食醋、醋精、甜味劑和食用香料調配而成，而采用蘋果鮮汁發酵的較少。隨著人們對蘋果醋產品保健效果的認知，以蘋果鮮汁為原料釀造的蘋果醋市場前景廣闊[5-6]，蘋果醋發酵技術也已成為蘋果精深加工重點開展的研究方向之一。近年來對蘋果醋發酵工藝和技術的研究較多，但大多集中在菌種選育、實驗室搖床工藝優化及分析上[7-12]，只有少量利用醋酸專用發酵罐（自吸式發酵罐）進行食醋發酵的研究報道[13]，而蘋果醋發酵工藝優化研究則鮮見報道。鑒于此，本試驗對蘋果醋發酵工藝進行了分析，并采用響應面法對蘋果醋發酵過程的發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速和接種量4 個因素的最佳工藝參數進行了探討，旨在為蘋果醋的工業生產提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

（1）菌種：釀酒酵母CTCF0001（Saccharomyces cerevisiae CTCF0001），醋酸菌 CTCF0001（Acetobacter aceti CTCF0001），以上兩株菌均來自中華全國供銷合作總社濟南果品研究院發酵技術研究室。

（2）原料：煙臺紅富士蘋果，綠杰股份有限公司；果膠酶，NOVOZYMES 公司。

（3）試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水合硫酸銅、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、葡萄糖、硫酸鎂等，均為分析純；酵母膏、瓊脂粉、食用酒精。

（4）培養基：液體種子培養基（葡萄糖1%、酵母膏1.5%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.05%，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后添加3%的酒精）；二級種子培養基：將經酵母發酵的蘋果酒稀釋至酒精度為3%～4%作為二級種子培養基。

1.1.2 儀器與設備

數顯式電熱恒溫水浴鍋，HH-4 型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；全自動立式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A 型，上海博迅實業有限公司；智能型垂直流超凈工作臺，SW-CJ-2FD 型，蘇州安泰空氣技術有限公司；全溫度恒溫調速搖床柜，ZWYR-2112B 型，上海智誠分析儀器制造有限公司；數碼生物顯微鏡，BA310C，Motic 麥克迪奧實業集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果醋發酵工藝流程

蘋果→破碎→榨汁→一次殺菌→接種酵母菌（添加酶制劑）→酒精發酵→二次殺菌→接種醋酸菌→醋酸發酵→除渣→陳釀→過濾→三次殺菌→成品

1.2.2 操作要點

（1）酒精發酵

無菌條件下在發酵料液中接入適量的酵母菌，發酵初期可通入適量的空氣，以利于酵母菌的迅速繁殖和酒精發酵，控制合適的發酵溫度。當發酵液中酒精度在6.5%（v/v）以上、殘還原糖含量在0.5%～0.6%時，即可認為酒精發酵結束，測定并記錄發酵液的酒精度。

（2）醋酸菌的培養

一級種子培養：取一環活化后的醋酸菌種接入裝有10 mL 液體種子培養基的試管中，在旋轉式恒溫搖床上于33 ℃、200 r/min 培養24 h。

二級種子培養：以1%（v/v）的接種量將培養24 h 后的一級種子轉接至裝有300 mL 二級種子培養液的兩個1 000 mL 搖瓶中，在旋轉式恒溫搖床上于33 ℃、200 r/min條件下培養24 h。

（3）醋酸發酵

在酒精發酵醪液中接入醋酸菌二級種子液，控制合適的溫度、轉速、發酵時間等工藝參數，同時定時取樣測定發酵液中的總酸，當總酸不再增加時，醋酸發酵結束。

1.2.3 醋酸發酵優化試驗設計

（1）單因素試驗

選擇發酵溫度33 ℃、發酵時間36 h、醋酸菌接種量8%、攪拌速率1 400 r/min 為因素，以發酵醪液中的總酸含量（即酒精的轉化率）為考察指標，每次變化一個因素水平進行不同發酵溫度、發酵時間、醋酸菌接種量和攪拌速率四項單因素試驗。

（2）響應面優化試驗

在單因素的基礎上，以醪液中總酸含量為考察指標，以發酵溫度、發酵時間、醋酸菌接種量和攪拌速率4 個因素為自變量，再用Design Expert 8.0 軟件進行響應面優化，分析蘋果醋發酵的最佳條件。

1.3 測定指標與方法

總酸：酸堿滴定法測定，參照GB/T12456-2008。

1.4 數據處理

通過Microsoft Excel 和Design Expert 8.0 軟件統計分析試驗數據，并對實驗數據所得響應面模型進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果醋發酵的單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發酵時間48 h、醋酸菌接種量8%、攪拌轉速1 400 r/min 的條件下，設定醋酸菌的發酵溫度分別為27、30、33、36、39 ℃時，考察蘋果醋發酵溫度對總酸生成量的影響，試驗結果見圖1。

數據挖掘系統結構包括將數據挖掘系統與數據庫/數據倉庫系統耦合的各種考慮。有多重可能的設計:不耦合、松散耦合、半緊密耦合和緊密耦合。一個良好的設計的數據挖掘系統應當與數據庫和/或數據倉庫的緊密或半緊密耦合。這里所謂的“耦合(Coupling，結合，連結)”實際上就是要求多邊矩陣剖面廣義交叉乘積的運算方法應保證運算結果矩陣的階數不高，數據信息比較集中。

圖1 顯示了發酵溫度對醋酸菌的產酸速率具有顯著影響。發酵溫度過低，發酵緩慢、產酸速率低；發酵溫度過高則導致酒精和醋酸菌的揮發加快，醋酸會氧化為二氧化碳和水，醋酸菌老化提前，使醋酸發酵效率變低。由圖1 可知，在發酵溫度為27 ℃和30 ℃時，醋酸菌產酸速度慢、時間長，最終發酵醪液中的總酸含量低。在發酵溫度為33 ℃和36 ℃時，產酸量高，其中33 ℃終發酵醪液的總酸含量最高，發酵時間只需36 h。當發酵溫度為39 ℃時，過高的發酵溫度導致菌種提前老化，即使有較短的發酵周期，但是產酸量低。由試驗結果得知，醋酸發酵的最佳溫度為33 ℃。

2.1.2 發酵時間對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發酵溫度33 ℃、醋酸菌接種量8%、攪拌轉速1 400 r/min 的條件下，設定醋酸菌的發酵時間分別為24、30、36、42、48 h 時，考察蘋果醋發酵時間對總酸含量的影響，試驗結果見圖2。

醋酸菌發酵分為三個階段。發酵前期是醋酸菌種適應期，菌種生長緩慢、產酸量少，發酵醪液酸度低；中期為醋酸菌的對數生長期，產酸速率加快，總酸快速增長；后期開始為醋酸菌氧化酶大量分泌，催化乙醇與空氣中的氧結合形成乙酸，但氧化反應逐漸變緩，酸度趨于穩定，發酵時間繼續延長，醪液中的醋酸含量反而緩慢下降。由圖2 可知，發酵時間24～30 h 是蘋果醋的總酸快速增加期，發酵時間在30～36 h 時，發酵液中的總酸繼續增加，但總酸增加速率放緩，發酵36 h 時，蘋果醋中的總酸達到最大值；發酵后期，醋酸菌活力減弱，酸度趨于穩定。若繼續延長發酵時間，醋酸含量反而會下降，分析其原因，可能是因為耗氧發酵帶走的醋酸產生量小于少量殘余酒精轉化成醋酸的量以及醋酸被轉化為二氧化碳和水的量。根據試驗結果，選擇醋酸發酵的最佳時間是36 h。

2.1.3 醋酸菌接種量對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發酵溫度33 ℃、發酵時間48 h、攪拌轉速1 400 r/min 的條件下，設定醋酸菌的接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%時，考察醋酸菌的接種量對蘋果醋總酸含量的影響，試驗結果見圖3。

由圖3 可得，在其它條件一定的情況下，醋酸菌接種量為4%和6%時，發酵速率較為緩慢，產酸量相對較低；在醋酸菌接種量為8%和10%時，發酵醪液中的總酸變化趨勢基本一致，12～30 h 產酸速率較快，發酵36 h 時，以8%接種量的發酵醪液中總酸濃度最高，36 h 后發酵醪液中的總酸含量有下降的趨勢。當接種量為12%時，短時間內產酸速率最快，但最終發酵醪液中的總酸含量低于8%和10%接種量的總酸含量，分析其原因可能是因為接種量過多，發酵液中的營養物質并沒有相應的增加，但是醋酸菌在生長繁殖時需要消耗較多的營養物質，造成醋酸生成量的減少，而且較大的接種量對發酵產品的風味會有不良影響[14]。結合試驗數據分析，選擇醋酸發酵的最佳接種量為8%。

2.1.4 攪拌轉速對蘋果醋發酵總酸含量的影響

在蘋果醋發酵溫度33 ℃、發酵時間48 h、醋酸菌接種量8%的條件下，設定攪拌轉速分別為800、1 100、1 400、1 700、2 000 r/min 時，考察攪拌轉速對總酸生成量的影響，試驗結果見圖4。

由圖4 可知，攪拌轉速對蘋果醋發酵具有較大的影響。攪拌轉速和發酵液中的溶氧存在較大的相關性。在發酵前12 h，由于醋酸菌對氧的需求較少，攪拌速率對醋酸的生成影響較??；發酵12 h 后，攪拌轉速為800 r/min和1 100 r/min 時，由于發酵液中溶解氧的不足使得醋酸的生成較為緩慢，但攪拌轉速1 100 r/min 的醋酸生成速率明顯快于攪拌轉速800 r/min 的醋酸生成速率；發酵速率高于1 400 r/min 時，發酵時間在0～36 h 的總酸增長曲線基本一致，但在30 h 后，以1 400 r/min 攪拌轉速醪液中的總酸含量最高。分析其原因可能因為一方面過多的溶解氧使得醋酸菌生長旺盛，耗去發酵液中大量養分，另一方面轉速過高使發酵液中酒精和醋酸揮發，發酵到后期轉化率不斷下降。因此，攪拌轉速選擇1 400 r/min。

2.2 蘋果醋發酵的響應面試驗

2.2.1 響應面分析方案及結果

在單因素試驗的基礎上，為了研究不同因素對總酸（醋酸）生成的影響，確定最優的蘋果醋發酵工藝參數，選擇發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速、接種量作為響應面優化的考察因素。根據Design Expert 8.0 軟件中的Box-Behnken 設計原理，設計四因素三水平響應面優化分析試驗，以發酵醪液中的總酸生成量為響應值（Y），用-1、0、1來表示因素低、中、高三水平，試驗設計見表1，結果見表2。

表2 的試驗結果包括24 個取值在A、B、C、D 所構成的三維頂點，5 個區域零點重復試驗點。對表中的試驗結果進行回歸分析，得到蘋果醋發酵過程中總酸含量對發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速、接種量的四元二次回歸方程：Y=60.42+1.31A+3.05B+1.84C+1.92D+0.20AB-1.92AC-1.90AD-0.025BC-0.68BD-0.48CD-2.35A2-2.83B2-1.95C2-2.46D2。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 響應面試驗設計及響應值Table 2 Response surface experimental design and results

對所得回歸方程進行變異分析和顯著性檢驗結果如表3 所示。由表3 可以看出，模型的回歸項P＜0.013 9，表明所選擇的響應面回歸模型顯著。失擬項P=0.997 1＞0.05，即失擬項差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠顯著擬合發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速、接種量對蘋果醋中總酸生成量的影響，該模型能夠替代試驗真實點對試驗數據進行分析。從表3 可得出四元二次回歸方程系數的顯著性，攪拌轉速（C）、接種量（D）、發酵溫度二次項（A2）、發酵時間二次項（B2）對蘋果醋發酵的總酸含量具有顯著影響；發酵時間（B）對蘋果醋發酵的總酸含量具有高度顯著影響；發酵溫度（A）、發酵溫度（A）和發酵時間（B）的交互項、發酵溫度（A）和攪拌轉速（C）的交互項、發酵溫度（A）和接種量（D）的交互項、發酵時間（B）和攪拌轉速（C）的交互項、發酵時間（B）和接種量（D）的交互項、攪拌轉速（C）和接種量（D）的交互項對蘋果醋發酵的總酸含量影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應面模型分析討論

利用Design Expert 8.0.5b 軟件對表2 的試驗數據進行四元二次回歸擬合分析，所得響應面圖見圖5～10。各因素及其交互作用對蘋果醋總酸生成量的影響結果可通過響應面圖直觀地反映出來。其中響應面圖底部的等高線可以反映兩因素相互作用的強弱，橢圓形表示兩因素相互作用較強，圓形表示較弱[15-16]。圖5 為發酵溫度和發酵時間對醋酸生成量的影響，由圖可知，發酵溫度和發酵時間對醋酸生成量的交互作用較強，發酵時間較發酵溫度對醋酸生成量的影響大，表現為等高線較陡和密集。圖6 為發酵溫度和攪拌速率對醋酸生成量的影響，由圖可知，發酵溫度和攪拌速率對醋酸生成量的交互作用較強，發酵時間和攪拌速率對蘋果醋總酸的生成量均有顯著影響。

圖7 為發酵溫度和接種量對蘋果醋總酸生成量的影響，由圖可知，發酵溫度和接種量對總酸生成量的交互作用較強，蘋果醋發酵接種量大于發酵溫度對總酸生成量的影響。圖8 為發酵時間和攪拌速率對總酸生成量的影響，由圖可知，發酵時間和攪拌速率對總酸生成量的交互作用較強，發酵時間和攪拌速率對蘋果醋總酸生成量均有較大影響。圖9 為發酵時間和接種量對總酸生成量的影響，由圖可知，發酵時間和接種量對總酸生成量的交互作用較強，發酵時間對蘋果醋總酸生成量的影響稍微強于接種量。圖10 為攪拌速率和接種量對總酸生成量的影響，由圖可得，攪拌速率和接種量對總酸生成量的交互作用較強，接種高于攪拌速率對總酸生成量的影響。

2.2.3 最佳工藝參數的預測和驗證

運用響應面軟件對試驗數據進行優化和預測，得到蘋果醋發酵總酸生成量的最佳工藝參數為發酵溫度33℃、發酵時間39 h、攪拌速率1 529.1 r/min、接種量7.3%，在此工藝參數下預測發酵醪液中醋酸生成量為61.9 g/L。結合實際生產的可操作性，將醋酸發酵的工藝參數改為發酵溫度33 ℃、發酵時間39 h、攪拌速率1 500 r/min、醋酸菌接種量7%。在此工藝參數下對模型的預測參數進行驗證，得到發酵蘋果醋的總酸含量為62.22 g/L，與模型預測值很接近，說明采用響應面法優化得到的醋酸發酵的工藝參數可靠。

3 結論

以煙臺富士蘋果為原料，通過單因素試驗初步研究了發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速和接種量對蘋果醋總酸生成量的影響。通過響應面分析方法建立了蘋果醋總酸發酵工藝參數，即發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速、接種量對蘋果醋發酵總酸含量之間的響應面模型，可用于蘋果醋發酵總酸含量的預測。在響應面試驗所取發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速、接種量參數的優化區間內，發酵溫度對蘋果醋發酵總酸含量影響不顯著，發酵時間對蘋果醋發酵總酸含量影響極顯著，攪拌轉速和接種量對蘋果醋發酵總酸含量具有顯著影響，發酵溫度、發酵時間、攪拌轉速和接種量各因素交互作用對總酸含量的影響不顯著。試驗得出，蘋果醋發酵的最佳工藝參數為發酵溫度33 ℃、發酵時間39 h、攪拌速率1 500 r/min、醋酸菌接種量7%。