妊娠期高血壓病中醫證候與體質分布及循環MicroRNA的研究

熊智慧 王欣晨 官海漣

妊娠期高血壓疾?。℉ypertensive disorder of pregnancy，HDP）是妊娠期特有疾病，發生率為5%～15%［1］。目前其病因和發病機制仍未明確，西醫主要的治療方法是解痙降壓、適時終止妊娠等對癥治療，但這也是引起圍產兒并發癥和病死率上升的主要原因［2］。中醫將整體觀和辨證施治相結合，從未病先防、既病防傳的中醫思想入手，在改善妊娠期高血壓疾病患者的妊娠結局及長期預后方面有所突破［3］。近年來，關于MicroRNA與妊娠期高血壓疾病研究也逐漸增多［4-5］。但目前臨床僅有少量研究顯示妊娠期高血壓疾病與中醫證型、中醫體質分布情況以及相關MicroRNA的研究。本資料通過長期臨床觀察和總結，將進一步研究其中醫證候與中醫體質分布情況，并通過明確、量化的科學手段對妊娠期高血壓疾病證候變化的血液MicroRNA進行檢測，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2018年12月在本院產科就診的298例妊娠期高血壓疾病患者以及30例正常妊娠孕婦，對其年齡及孕周匹配。因妊娠期高血壓、子癇前期和子癇與慢性高血壓在發病機制及臨床處理上均不同，本研究只納入前三種疾病。即妊娠20周后出現收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，伴有或不伴有24h尿蛋白≥0.3g，或隨機尿蛋白（+）。所有的參與者均簽署書面知情同意書，并得到本院倫理委員會的批準。診斷、納入及排除標準：診斷標準西醫診斷標準參照中華醫學會婦產科分會制定的《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015年）》［6］，中醫診斷標準參照張玉珍主編的十一五規劃教材第七版《中醫婦科》及《中藥新藥治療妊娠期高血壓疾病的臨床研究指導原則》［7］，對妊娠期高血壓疾病進行中醫辨證分型及中醫癥狀分級量化。納入標準：符合上述中西醫診斷標準：能夠如實回答調查者的問題，在知情同意情況下自愿參與調查。上述2個標準全部符合方可納入。排除標準：慢性高血壓患者；不符合納入標準者；合并有其他內外科疾病及妊娠期特有疾病患者。上述3個標準有任何1個或以上符合即可排除。

1.2 方法 主要采用問卷調查獲得一般資料，中醫診斷獲得四診信息以及根據相關量表判定中醫證候及體質類型，并采用熒光定量qRT-PCR技術檢測血液中MicroRNA中的表達，最后統計分析妊娠期高血壓疾病患者中醫證候和中醫體質的分布及血液中MicroRNA的表達情況。（1）中醫證候評定標準：根據《中醫婦科學》中妊娠期高血壓疾病的中醫證候分型和近20年有關中醫治療妊娠期高血壓疾病的現代文獻進行統計分析的數據，初步將該病分為脾虛濕盛證、腎虛水泛證、脾虛肝旺證、陰虛肝旺證。但在臨床辨證時調查者可按中醫臨床辨證標準，如實辨證分型并注明具體的辨證分型。經由＞3名中醫專家討論辨證，得出每人的中醫證候類型。（2）中醫體質判定標準：參照2009年中華中醫藥學會制定的中醫體質分類與判定標準，將中醫體質分為平和質、氣虛質、陽虛質、陰虛質、痰濕質、濕熱質、瘀血質、氣郁質、特稟質9個類型，根據量表5級評分計算并轉化分數。（3）中醫證型和相關循環MicroRNA的測定：①標本的采集與保存：患者在入組后次日清晨空腹抽取肘靜脈2ml，置于真空采血管（EDTA-K3抗凝管）中。樣品經4℃，3000r/min離心15min，取血漿，每500μl分裝至無核糖核酸的EP管中，-80℃冰箱儲存，用于microRNA檢測。②血清miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210的檢測：采用熒光定量qRT-PCR技術進行檢測，具體過程為：依據miRBASE（http：//www.mirbase.org/）數據庫4種MicroRNA的序列，設計特異性PCR擴增引物；采用Qiagen公司的血清試劑盒，對血漿總RNA進行提??；利用NanoDrop2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）測定濃度及OD260/OD280；配置逆轉錄反應體系，利用miScriptⅡ Reverse Transcription Kit將待測RNA逆轉錄成cDNA。利用SYBR GreenI Master試劑盒在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR檢測。具體過程：配置PCR儀上進行熒定量PCR檢測。具體過程：配制PCR反應體系；預變性：95℃10min；高溫變性：95℃下10s；低溫退火與延伸：60℃下30s；高溫變性、低溫退火與延伸進行40個循環；從60℃緩慢升溫至97℃，每攝氏度采集5次熒光信號。記錄測定達成所設定的閾值時所經歷的循環數即Ct值；利用溶解曲線檢測引物的特異性。表達量的計算采用 2-△△Ct法?！鰿t=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct實驗組樣品-△Ct對照組樣品，相對表達量 =2-△△Ct=2-（△Ct實驗組樣品-△Ct對照組樣品）=2-△Ct實驗組樣品/2-△Ct對照組樣品。具體計算時以對照組表達量為1，則比值即為實驗組的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件。采用多元回歸分析、χ2檢驗、方差分析等方法進行分析與歸納。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較 見表1。

表1 各組臨床資料比較（）

表1 各組臨床資料比較（）

注：與妊娠期高血壓比較，*P＜0.05；與重度子癇前期比較，#P＜0.05；與輕度子癇前期比較，▲P＜0.05

重度子癇前期（n=69）年齡 27.70±2.95* 30.36±4.49# 30.64±5.54# 33.57±4.38▲孕周（周） 37.13±1.11# 38.49±1.30▲ 37.68±1.94# 36.42±1.94*初產婦（n） 25 128 62 46經產婦（n） 5 20 19 23單胎（n） 26 145 74 64雙胎（n） 4 3 7 5 SBP（mmHg） 124.92±3.24* 145.60±1.79# 157.17±5.83 158.65±5.01▲DBP（mmHg） 74.99±2.40* 95.72±1.67# 97.95±3.39 98.70±4.70▲尿蛋白（g/24h） 0.05±0.02* 0.18±0.10* 0.85±0.40# 5.50±3.52▲組別 正常組（n=30）妊娠期高血壓（n=148）輕度子癇前期（n=81）

2.2 妊娠期高血壓疾病患者中醫證候分布情況 見表2。

表2 298例妊娠期高血壓疾病中醫證型構成統計（n）

2.3 妊娠期高血壓疾病患者中醫體質分布 見表3。

表3 妊娠期高血壓疾病患者中醫體質分布

2.4 妊娠期高血壓疾病患者中醫證候與體質的相關性分析 見表4。

2.5 正常組及妊娠期高血壓疾病患者中醫證型循環MicroRNA表達的比較 見表5。

3 討論

體質是在先天與后天基礎上表現出的機體形態結構和生理機能相對穩定的特質，代表機體發病的內環境。證是機體正邪交爭的動態性、階段性的病理概括。體質是證的基礎，證是致病因素作用于人體體質以后形成的臨床類型。本資料調查顯示，不同的體質證型決定了臨床疾病的嚴重程度，妊娠期高血壓、輕度子癇前期及重度子癇前期與其體質具有顯著差異（P＜0.01），其中以氣虛質及陰虛質關系最為密切，妊娠期高血壓在臨床上多表現為脾虛濕盛型和脾虛肝旺型，而輕度子癇前期及重度子癇前期多表現為脾虛肝旺型和陰虛肝旺型，說明不同體質差異對妊娠期高血壓疾病的證型影響有明顯差異，并決定了疾病的臨床表現形式。

表4 特定證候類型患者體質類型分布［n（%）］

表5 正常組及妊娠期高血壓疾病患者中醫證型循環循環MicroRNA的表達

先天體質是中醫證型形成的基礎，中醫證型必然表現各自體質的特點，而隨著現代分子生物學的發展，逐步研究發現了基因表達差異會造成許多疾病不同個體間的差異，中醫證型可能與基因有密切地聯系，臨床上證型相同的患者可能存在較為一致的病理改變及相同的基因變異［8］。近年來研究發現MicroRNA參與了妊娠期高血壓疾病的演進，是妊娠期高血壓疾病發生、發展的重要分子，其中miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210逐步受到關注［9］。本次調查發現，妊娠期高血壓疾病患者血液中檢測到的miR-885-5p及miR-26a-5p分別在陰虛肝旺型和脾虛肝旺型表達中有顯著差異（P＜0.01），而腎虛水泛型患者血液中檢測到的miR-155、miR-210表達水平顯著高于其他證型組（P＜0.01）。由此可以推斷，證型的出現可能是機體對不同的分子病理所作出的反應，也可能提示妊娠期高血壓疾病發展過程中證型的轉變預示疾病不同的病理改變，當機體出現脾虛濕盛證型時，常見為妊娠期高血壓患者，臨床表現主要以血壓的輕度升高為主；而隨著疾病的演變和進展，當機體出現脾虛肝旺及陰虛肝旺證型時，常見為子癇前期患者，臨床表現除了血壓升高外，還伴有機體其他臟器不同程度的受累，而其內在機制可能與血液中MicroRNA的調控有關，提示妊娠期高血壓疾病患者血液中MicroRNA的表達水平與中醫證型及中醫體質存在一定的聯系。

本次調查在對妊娠期高血壓疾病中醫證型分布和中醫體質及循環MicroRNA的探討中，尚缺乏大樣本、多中心的研究調查，對其辨證分型存在一定主觀因素，同時，本次調查只是對臨床上常見的證型進行了初步的探討，下一步需要擴大樣本量，進一步全面分析中醫證型和中醫體質及循環MicroRNA的關系，揭示中醫證型的實質和科學內涵，為中醫辨證客觀化研究提供依據。