不同預處理方式對海南山柚油感官特性及抗氧化抑菌作用的影響

郭海陽 譚海生 楊勁松 鄭小燕 盛占武

(海南大學食品科學與工程學院1，?？?570228)(海南大學材料科學與工程學院2，?？?570228)(中國熱帶農業科學院?？趯嶒炚?，?？?570102)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，又名茶子樹、茶油樹，為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)植物，是我國特有的一種極其珍貴的油料木本植物，種植、栽培歷史悠久，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種[1-3]。在海南，油茶通常被稱為山柚，其籽所制得的油脂被稱為山柚油。海南山柚雖屬茶油中的一種，但是由于海南島獨特的地理環境，產出了品質優良的山茶籽，山柚油的特性有別于內地，尤其口感和品質較為特殊，其價格也是內地油茶籽油的5～10倍[4]。馮棋琴等[5]采用頂空取樣GC-MS聯用技術發現山柚油主要揮發性風味成分含量與內地山茶油區別較大，山柚油中含量最高的為壬醛，且庚醛、1-辛烯-3-醇、正辛醛、2-正戊基呋喃、1-庚醇含量明顯高于內地山茶油。

山柚油中的主要成分是油酸，所占總質量分數高達75%左右，脂肪酸的組成也與橄欖油十分相似，而且山柚油中富含多種橄欖油中沒有的物質，如茶皂素、茶多酚等，具有降低膽固醇和防輻射等作用[6]。據李麗等[7]的研究，山柚油中不皂化物含量少，易消化吸收，含有豐富的生育酚，對人體中樞神經系統、心血管系統、維持骨骼肌結構和功能以及促進生育功能、增強機體免疫能力等方面都具有積極作用。根據陳梅芳等[8]的研究，茶油還能夠降低血脂、肝脂，并顯著延緩動脈粥樣硬化，對人體健康十分有益。山柚油營養成分含量豐富，而且還有很高的藥用價值，對消腫、止癢、刀傷、燙傷、撞傷有功效[9，10]。

油茶籽經過烘烤、焙炒、微波等預處理，自身含有的蛋白質、糖類、油脂在高溫有氧氣條件下會發生一系列化學反應，加工工藝對山柚油的風味、品質和抗氧化活性有顯著影響。目前對山柚油的研究僅集中在其理化特性和組分分析上，對山柚油的抑菌功能及抗氧化功能特性研究甚少，而且鮮有關于預處理方式對山柚油品質影響的研究。選擇適宜的預處理方法對優化山柚油的提取工藝，提高茶油品質十分必要[11]。因此，本研究采用焙炒、烘烤、微波等預處理方法處理油茶籽，經壓榨所得的山柚油通過DPPH法、ABTS法以及羥基自由基清除率的測定，來分析評價經過不同預處理的山柚油的抗氧化能力差異，以找出最適合山柚油的預處理方式，為今后海南油茶籽高值化加工技術的發展和高品質、高附加值山柚油產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山柚籽：產自海南，含水量10%，含油量30%～40%。

ABTS[2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽]、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)；二甲基亞砜、異丙醇等均為化學純；其他試劑均為分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)：海南大學微生物實驗室保藏菌株。

1.2 儀器與設備

LTP205家用小型榨油機；WG70CTL20II-K6微波爐；KWS1530X-H7R格蘭仕電烤箱；APY-01大功率電磁爐；SW-CJ-17-D超凈工作臺；SKP-01電熱恒溫培養箱；UV-1100紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 山柚油茶籽的預處理及榨油流程

稱取200 g經干燥脫殼后的山柚籽，平均分為4份，參考龍婷等[12]的方法，山柚分別進行焙炒、烘烤、微波處理，以未處理的山柚為未處理組，具體工藝流程：

焙炒處理：焙炒(將油茶籽在150 ℃下焙炒15 min，焙炒時注意避免油茶籽被炒糊、炒焦)→碾碎→壓榨→山柚油。

烘烤處理：烘烤(將油茶籽置于烘箱中，于120 ℃下烘烤30 min)→碾碎→壓榨→山柚油。

微波處理：微波(頻率2 450 MHz，功率700 W，間歇微波5次，每次2 min)→碾碎→壓榨→山柚油。

未處理(未處理組)：碾碎→壓榨→山柚油。

1.3.2 山柚油的感官評定方法

參考植物油感官分析方法[13]，結合山柚油的感官特點，分別從山柚油的色澤、香味、透明度、黏度對茶油進行感官評價。選擇30名具備相關專業知識的人員組成感官評定小組，并對成員進行感官分析培訓。評價過程采取雙盲實驗方法，不告知主試實驗目的及茶油展示順序，對每個評價員按隨機順序展示經過不同預處理的茶油，避免主試效應對實驗結果產生影響，按表1進行感官評定。

表1 山柚油感官評分表

1.3.3 山柚油的抗氧化活性測定

1.3.3.1 山柚油清除DPPH·自由基能力的測定

首先選取新鮮榨好的山柚油使用無水乙醇進行梯度稀釋，將純山柚油稀釋至4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL。再準確稱量0.039 4 g DPPH·用無水乙醇定容至100 mL，再用無水乙醇稀釋為1×10-4mol/L的DPPH·溶液。利用溶液的特征紫紅色團在517 nm處的吸收峰，使用紫外可見分光光度計測定加入山柚油后A517吸收的下降表示茶油對有機自由基的清除能力，反應總體積為4 mL[14]。將不同濃度的樣品分別取2.0 mL，與配制好的DPPH溶液等量混合，避光放置30 min進行反應，以無水乙醇作為參比溶液測定517 nm波長下的吸光度的變化。并按照公式對抗氧化物質的抑制率進行計算：

式中：A0為DPPH·與無水乙醇混合溶液在517 nm的吸光度；Ai為DPPH·與山柚油避光反應30 min后的溶液在517 nm的吸光度；Aj為山柚油與無水乙醇混合溶液在517 nm處的吸光度。最后再根據測得的I來制作一元回歸方程以求得樣品對DPPH的半抑制濃度(IC50)。山柚油的抗氧化能力通過半抑制濃度IC50來表示，IC50越小，抗氧化能力越強。

1.3.3.2 山柚油對ABTS+·清除能力的測定

參考楊少輝等[15]的方法并稍加改進，將7.0 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等量混合，置于暗處反應12 h得到ABTS+·。使用甲醇稀釋ABTS+·溶液，直到ABTS+·溶液在734 nm處吸光度為(0.70±0.02)。使用甲醇梯度稀釋山柚油樣品，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-甲醇溶液，取25 μL不同濃度的山柚油-甲醇溶液加入到2 mL的ABTS+·溶液中，靜置混合6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(Ai)。將25 μL甲醇溶液與2 mLABTS+·溶液中，靜置加入到ABTS混合6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(A0)。最后取2 mL甲醇溶液與25 μL樣品溶液混合，靜置6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(Aj)。重復測定3次，按照公式對抗氧化物質的抑制率進行計算：

式中：A0為甲醇溶液與ABTS+·溶液混合后在734 nm處的吸光度；Ai為山柚油-甲醇溶液與ABTS+·溶液混合后在734 nm處的吸光度；Aj為甲醇溶液與山柚油-甲醇溶液混合后在734 nm處的吸光度。

根據所測得的抑制率來制作一元回歸方程，計算出抑制率在50%時的用量，即半抑制濃度(IC50)。以質量濃度0.02 mg/mL的VC溶液為參照，通過比較二者的IC50的值來計算樣品相當于VC的用量，即VC當量(mg/mL VC)[16]。

1.3.3.3 山柚油對羥基自由基清除能力的測定

根據芬頓反應(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH·)，用亞鐵離子作為催化體系，用雙氧水作為氧化劑的氧化反應體系，可以在反應中生成羥基自由基，根據與水楊酸-乙醇反應體系的氧化情況，確定待測樣品能否對羥基自由基產生清除效果。在化學反應過程中，二價鐵離子被其氧化成三價鐵離子可能發生混凝反應從而生成沉淀[17]。測定步驟：

1)使用無水乙醇將4種不同預處理的山柚油進行梯度稀釋，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-無水乙醇溶液；

2)準確稱量0.083 4 g七水合硫酸亞鐵，用少量蒸餾水溶解，然后轉移至50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，以制備6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液；

3)準確稱量0.041 4 g水楊酸，用少量無水乙醇溶解，然后轉移至50 mL容量瓶中用無水乙醇定容，以制備6.0 mmol/L的水楊酸-乙醇體系；

4)用移液槍準確量取30%濃度雙氧水溶液167 μL，轉移至50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，以制備0.1%的雙氧水溶液；

5)按順序在10 mL試管中加入1 mL 6.0 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液，1 mL 6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液，不同濃度的茶油-無水乙醇溶液，最后加入0.8 mL雙氧水溶液，搖勻后放置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min后離心，在3 500 r/min速度下離心10 min，取上清液在510 nm處測定其吸光度值，以無水乙醇取代雙氧水為對照組，以無水乙醇取代山柚油-乙醇溶液為空白組，重復測定3次。按公式對抗氧化物質的抑制率進行計算：

式中：A0為無水乙醇代替山柚油-無水乙醇溶液的吸光度；Ai為山柚油-無水乙醇溶液反應后的溶液的吸光度；Aj為無水乙醇代替雙氧水對照組的吸光度。

1.3.3.4 山柚油不同預處理自由基清除能力的顯著性分析

采用SPSS 22.0軟件對不同預處理方式的自由基清除能力進行t檢驗分析。

1.3.4 山柚油的抑菌功能測定

1.3.4.1 培養基的制備

牛肉膏蛋白胨培養基的制備：取牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉20.0 g用蒸餾水將溶質搖動溶解，定容至1 000 mL后調pH至7.4～7.6，高壓蒸汽滅菌后進行倒平板操作，最后冷卻，放至4 ℃冷藏備用。

馬鈴薯淀粉培養基的制備：取39.0 g真菌用瓊脂培養基，用蒸餾水將溶質搖動溶解，定容至1 000 mL后調pH至7.4～7.6，高壓蒸汽滅菌后進行倒平板操作，最后冷卻，放至4 ℃冷藏備用。

1.3.4.2 山柚油的稀釋

用5%無菌吐溫-80溶液將山柚油配制成體積分數為5%的山柚油母液。將母液稀釋10倍，然后連續采用7次二倍稀釋法，最終形成相當于母液濃度0.1×20、0.1×2-1、0.1×2-2、0.1×2-3、0.1×2-4、0.1×2-5、0.1×2-6、0.1×2-7的山柚油溶液[18]。

1.3.4.3 菌懸液的制備

將已活化的菌株分別取1.0 mL菌液入9.0 mL無菌水中，得到濃度為1×10-1的菌懸液置于振蕩器上振蕩1 min, 取該懸液菌1.0 mL入9.0 mL無菌水中，得到濃度為1×10-2的菌懸液，依次進行梯度稀釋，稀釋成濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6的菌懸液。

1.3.4.4 山柚油最低抑菌濃度(MIC)的測定

分別選取濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5的菌懸液進行涂布操作，涂布后，在每個平板中放置1個已滅菌的牛津杯，向其中注入50 μL稀釋過的山柚油，每個牛津杯中注入1種濃度的山柚油，小心將平板移至培養箱中放置，其中，大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，放置在37 ℃培養箱中培養，放置8 h后，每隔1 h觀察1次，測定抑菌圈大小。黑曲霉(Aspergillusniger)放置在28 ℃培養箱中培養，放置32 h后，每隔1 h觀察1次，測定抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 山柚油感官分析評定結果與分析

將各預處理山柚油各項指標進行綜合評分，焙炒、烘烤、微波、未處理幾種山柚油的分數分別為3.49、3.80、4.11、3.14，可見，微波處理的綜合評分最高，并且對山柚進行適當的預處理有助于增加山柚油的風味。

圖1 不同預處理方式所得山柚油的感官評價的QDA圖

采用定量描述分析法(QDA)對感官品質進行分析，結果見圖1，經過焙炒的山柚油雖然在黏度、色澤、透明度這幾方面評分略低，甚至低于未處理組的得分，但是其氣味和滋味的得分最高，經過焙炒處理之后，山柚油表現出了一種特殊的香氣和滋味，并且呈現出的奶油味和堅果味相較其他幾種油更豐富，而且表現出的青草味、酸敗味等令人不愉悅的味道更淡。山柚在焙炒過程中，由于焙炒條件最為強烈，山柚的細胞壁被迅速破壞，由生變熟，香味得到釋放，因此香氣和滋味更為濃郁，但也由于其處理條件過于強烈，結構被破壞，導致榨得的山柚油色澤、透明度的得分均相對于未處理組有所下降。經過微波預處理的山柚油，各項指標均相對未處理組有較大提升，是一種優秀的山柚油預處理方法。

2.2 山柚油抗氧化性測定結果與分析

2.2.1 山柚油對DPPH·自由基清除能力的結果分析

經過不同預處理的山柚油對DPPH·自由基清除能力對比如圖2所示，山柚油無論是否進行預處理均有清除DPPH·自由基的能力，而且清除DPPH·自由基的能力與山柚油濃度之間存在明顯的正量效關系，自由基清除效果隨著濃度的增加而增強。但比較發現，經過焙炒處理的山柚油DPPH·自由基清除能力在高濃度時更為顯著，而微波處理和烘烤處理則無明顯差異，但經過預處理的山柚油清除自由基能力其他均高于未處理的山柚油。說明無論何種預處理方式均能提升山柚油清除DPPH·自由基的能力。

圖2 不同預處理方式的山柚油清除DPPH·自由基能力對比

表2 不同預處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(DPPH·法)

由表2比較，由于半抑制濃度越低，抗氧化能力越強，因此可以發現山柚油具有較強的抗氧化能力，且抗氧化效果焙炒處理最好，微波處理略優于烘烤處理。但經過預處理的山柚油的抗氧化均明顯優于未經過預處理的山柚油。

2.2.2 山柚油對ABTS+·自由基清除能力的結果分析

由圖3分析可以看出，3種經過預處理的山柚油對ABTS+·自由基清除能力明顯高于未經過預處理的山柚油，且清除ABTS+·自由基能力隨著山柚油濃度升高而變強，兩者之間存在明顯的正相關關系。且預處理能明顯提升山柚油的抗氧化能力。

經過表3數據分析比較可知，根據半抑制濃度越低，樣品抗氧化性越強的原理，經過焙炒預處理的山柚油抗氧化能力最好，經烘烤預處理的次之，經過微波預處理的最弱，但抗氧化能力均高于未處理組，說明山柚油具有良好抗氧化能力，且適當的預處理能顯著提高山柚油的抗氧化能力。

圖3 不同預處理方式的山柚油清除ABTS+·自由基能力對比

表3 不同預處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(ABTS法)

圖4 不同預處理方式的山柚油對羥基自由基清除能力對比

2.2.3 山柚油對羥基自由基清除能力的結果分析

根據圖4可以發現，山柚油對羥基自由基清除能力隨濃度加大而升高，且經過預處理的山柚油清除羥基自由基能力明顯好于未經過預處理的山柚油，說明預處理能明提升山柚油對羥基自由基的清除能力。

根據表4進行分析，半抑制濃度越低，則抑制效果越強，因此可以發現經過焙炒預處理的山柚油清除羥基自由基能力最好，其次是烘烤處理，再次是微波處理，未經過預處理的山柚油清除羥基自由基能力最弱，說明適當的預處理能提高山柚油對羥基自由基的清除效果。

表4 不同預處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(羥基自由基清除法)

2.3 山柚油對各自由基清除能力的差異性分析

利用SPSS統計軟件，應用t檢驗對不同預處理方式進行顯著性差異分析。

由表5可以看出，經過預處理的山柚油對DPPH的清除效果與未處理(對照組)相比較P值均小于0.01，表明差異非常顯著，且經過預處理的山柚油DPPH自由基清除效果均顯著高于未處理組的山柚油，其中焙炒處理及烘烤處理之間差異不顯著，焙炒處理與微波處理之間差異顯著，烘烤處理與微波處理之間差異不顯著。

由表6可以看出，經過預處理的山柚油對ABTS自由基的清除效果均顯著高于未處理組的山柚油，焙炒處理與烘烤處理得到的ABTS抑制率差異顯著，焙炒處理與微波處理得到的ABTS抑制率差異顯著，烘烤處理與微波處理得到的ABTS抑制率之間差異不顯著，并且經過焙炒處理的ABTS自由基清除效果顯著高于烘烤處理和微波處理。

由表7可以看出，經過預處理的山柚油對羥基自由基的清除效果均顯著高于未處理組，烘烤處理與微波處理之間無顯著差異，焙炒處理顯著高于烘烤處理和微波處理的抗氧化性。

由表5～表7可以看出，經過預處理的山柚油的抗氧化性均顯著高于未處理組山柚油的抗氧化性，焙炒處理山柚油的抗氧化性顯著優于烘烤及微波處理組山柚油的抗氧化性，烘烤處理及微波處理的山柚油的抗氧化性無明顯差異。

表5 DPPH自由基清除率差異性分析

注：P<0.05時差異顯著，P<0.01時差異極顯著,余同。

表6 ABTS自由基清除率差異性分析

表7 羥基自由基清除率差異性分析

2.4 山柚油抑菌效果實驗結果與分析

采用牛津杯法，以抑菌圈直徑大小為指標，研究山柚油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特菌及黑曲霉的抑制效果。最終僅有沙門氏菌存在直徑大小為22.0 mm的抑菌圈，說明山柚油對沙門氏菌存在抑制效果，且山柚油對沙門氏菌的最低抑菌濃度為 0.62%。山柚油對其他4種菌均沒有表現出抑菌效果。

3 結論

本研究通過感官評定的方法，并借助定量描述分析法得出合理的預處理有利于山柚油的感官特性，并最終確定最有利于山柚油感官指標的預處理方式是微波處理。通過DPPH法、ABTS法及測定羥基自由基清除率3個方法對山柚油的抗氧化特性進行綜合評定，最終發現進行有效的預處理均能增強茶油的抗氧化能力，其中焙炒處理效果很好，烘烤處理與微波處理差異不顯著，但均顯著高于未處理的山柚油。通過牛津杯法測定山柚油對大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)的抑菌效果，發現山柚油僅對沙門氏菌存在顯著的抑制效果。本研究結果表明適當的預處理能明顯提升山柚油的感官特性及抗氧化效果，油茶籽在適當的預處理(焙炒、烘烤、微波)過程中發生美拉德反應產生豐富的風味物質，提高了山柚油的感官品質，且微波預處理是從綜合角度考量最適合山柚油的預處理方式。