正丁醇同步萃取油茶餅多組分研究

謝益仙 肖志紅 吳 紅,,3 黎繼烈 張愛華, 李培旺 田 宏

(中南林業科技大學1，長沙 410004)湖南省林業科學院油脂分子構效湖南省重點實驗室2，長沙 410004)(湖南省林業科學院南方木本油料利用科學國家林草局重點實驗室3，長沙 410004)(湖南糧食集團有限公司4，長沙 410005)(南開大學5，天津 300071)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)被譽為世界四大木本油料之一[1]，屬茶科，常綠小喬木。油茶籽是我國重要的食用油原料，壓榨茶油后得到油茶餅，茶油餅中仍富含茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質、角鯊烯等多種天然活性成分[2-4]。茶皂素是一種糖式化合物，是一種天然非離子型表面活性劑[5]，具有鎮痛、抗滲透等藥理作用[6，7]，水提法和乙醇提取法的茶皂素碳水化合物含量高，進一步純化利用較為困難[8]。磷脂是天然表面活性劑，具有生理調節機能，在人體的新陳代謝、免疫力的提高、疾病的預防等方面都有一定的作用[ 9，10 ]，廣泛用于食品、醫藥、飼料、化妝品、紡織品、石油化工等行業[11]。油茶餅的開發利用有利于資源的再利用，可以產生一定的經濟效益。

油茶餅多組分提取方法有水提法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、亞臨界萃取法等。水提法設備條件要求不高、成本低、但目標產物提取率較低且需分步提取多組分，朱俊朋等[12]采用水提-醇萃法提取油茶餅中茶皂素時，在最佳提取條件下茶皂素提取率達到8.33%，提取率較低；有機溶劑萃取法成本低、效率高但產品的后續處理較為復雜且產品質量不高，宗毅等[13]采用超聲波-甲醇法提取茶皂素，在最佳實驗條件下的茶皂素純度達到59.30%；超臨界CO2萃取和亞臨界萃取操作簡單、目標產物提取率高但成本較高、設備投資較大且較難實現規?；a?？傊?，目前針對油茶餅中殘油、茶皂素、磷脂等多組分的提取技術存在耗時耗能、安全性低、產品質量不高的缺陷。根據本課題組前期研究得出醇基溶劑對油茶餅同步萃取效果優于常規有機溶劑，如以正丁醇水溶液為溶劑對茶皂素和茶油的同步提取，茶油提取率達到92.88%，茶皂素提取率達到43.20%[14]，實現了茶油、皂素和磷脂等多組分的同步萃取，而且后期通過簡單的旋轉蒸發就可以逐步實現油脂、皂素和磷脂的分離。與傳統方法對比，正丁醇水提取顯示出一定的優勢。因此，本實驗在課題組前期研究的基礎上，著力于正丁醇對油茶餅中多組分同步萃取的研究工作，重點探究正丁醇同步萃取油茶過程中更多組分溶出規律及其相互作用對茶皂素純度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽餅：湖南省林業科學院；茶皂素標準品；正丁醇、無水乙醇、石油醚、香草醛、濃硫酸、硫酸肼等試劑均為分析純。

UV-2800雙光束/紫外可見分光光度計；SZF-06A粗脂肪測定儀。

2 實驗方法

2.1 油茶餅原料的組分分析方法

2.1.1 油茶餅原料水分及揮發物的測定

油茶餅原料中水分及揮發物的測定方法同GB/T 10358—2008《油料餅粕水分及揮發物含量的測定》。

2.1.2 茶油的測定

油茶餅及濾渣中含油率的測定方法同GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》。

(1)

式中：M1為參與同步萃取的茶籽餅原料質量/g；P1為茶籽餅原料中的含油率/%；m1為茶籽餅濾渣的質量/g；P2為測得的茶籽餅濾渣的殘油率/%。

2.1.3 茶皂素含量的測定

茶皂素標準曲線及含量的測定按文獻[15]方法操作?？傻脴藴是€回歸方程為：

y=1.082 6x+0.002 7，R2=0.999 5。

(2)

(3)

式中：c為茶皂素質量濃度/mg/mL；V為茶皂素溶液的體積/mL；n為茶皂素溶液稀釋倍數；m為原料中茶皂素質量/mg；M為茶皂素提取物質量/mg。

2.1.4 磷脂含量的測定

磷脂標準曲線及含量的測定方法同GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》。

可得標準曲線回歸方程為：y=10.88x-0.033 2，R2=0.999。

(4)

式中：c為磷脂質量濃度/mg/mL；V為溶液的體積/mL；m為原料中磷脂質量/mg。

2.1.5 蛋白質含量的測定

油茶餅原料及濾渣中蛋白質的測定方法參考GB/T 31578—2015《糧油檢驗糧食及制品中粗蛋白測定杜馬斯燃燒法》。

2.1.6 碳水化合物含量的測定

油茶餅原料及溶出物質中碳水化合物的測定按文獻[16]方法操作。

2.1.7 油茶餅多組分同步萃取工藝

稱取500 g粉碎后的油茶餅粕(干基)，與一定體積的正丁醇在不同的pH(3.5～5.5)，溫度(50～90 ℃)，液料比(4∶1～12∶1) mL/g和正丁醇含水量(0%～20%)條件下回流萃取。提取完全后快速以確保體系在同等溫度下離心分離。之后用少量同溫度正丁醇與固體相混合后離心分離2次，合并正丁醇相。小心的收集固體相，用于油脂、皂素、磷脂、蛋白質和碳水化合物的提取率測定。旋轉蒸發儀蒸發，隨著含水量的減少，首先蒸發出來的是磷脂，其次是皂素，最后蒸發出來的是油脂，從而實現三組主要物質的分離。

2.1.8 響應面法優化油茶餅多組分同步萃取工藝

采用Box-Behnken中心組合實驗設計方案，根據單因素實驗固定正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，選取對油茶餅中茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大的萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個因素進行響應面分析，建立茶皂素溶出率及純度的回歸方程，優化茶皂素純度及萃取工藝參數。

3 結果與討論

3.1 茶籽餅中主要成分

表1所示為本實驗所用油茶餅中主要成分組成含量。由表1可知，油茶餅具有低蛋白質、磷脂含量，高茶皂素含量的特點，與文獻[17]相比，茶皂素、磷脂含量略高，這是因為原料產地、品種等都不相同。文獻中報道，雙親性的物質如茶皂素、磷脂和蛋白質等，對油脂的溶出有不同程度的促進作用，而每種物質的促進作用又各不相同。本實驗將重點研究各組分溶出的規律及其相互作用關系，尤其研究各組分相互作用對茶皂素純度的影響規律。

表1 油茶餅中主要成分組成

3.2 不同條件對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.1 pH對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的pH對皂素的溶出及純度具有非常顯著的影響作用[18]。茶皂素含有雙親基團具有表面活性，其表面活性容易受到體系pH的影響，在文獻報道中[19]發現茶皂素在弱酸性環境中表面活性較高。因此，考察體系pH的影響具有重要意義。

固定萃取溫度80 ℃、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在pH 3.5～5.5范圍內，隨著pH的升高，茶油、茶皂素、磷脂的溶出率及茶皂素純度呈現出先增加后減少的趨勢，蛋白質的溶出率呈現先減少后增加，碳水化合物溶出率有輕度增加。當pH增加到4.5時，茶油溶出率63.56%升高到74.01%，茶皂素溶出率從87.05%升高到90.60%，磷脂溶出率從29.96%增加到38.02%，茶皂素純度從71.35%增加到77.50%，蛋白質溶出率從30.54%降低到27.93%。在提取體系pH變化過程中茶油、茶皂素、磷脂溶出率及茶皂素純度變化趨勢相同，與蛋白質溶出率變化趨勢相反，萃取pH對茶皂素純度影響較大，與胡福田等[20]采用微波預處理超聲波協助水浸提茶皂素試驗相比茶皂素純度提高22.82%，蛋白質溶出率較低，其等電點在4.5左右[21]，體系中茶皂素與茶油分子溶出能力較強，茶皂素能降低水的表面能且對茶油具有一定的增溶作用[22]。綜合考慮選取pH 4.5為最佳萃取溫度。

3.2.2 溫度對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的溫度對茶皂素的提取率及純度都有較大的影響[23]，溫度過低，不利于各組分溶出，溫度過高會使更多的雜質溶出降低茶皂素的純度。

固定萃取pH 4.5、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在溫度50～80 ℃時，茶油、茶皂素溶出率及茶皂素純度均呈上升趨勢，低溫影響茶油及皂素在正丁醇水溶液中的溶解度[24]。在80～90 ℃茶油和茶皂素溶出率及茶皂素純度都有少許降低；隨著溫度增加磷脂溶出率從30.48%增加到38.91%，而蛋白質和碳水化合物溶出率呈現減少趨勢，蛋白質溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對茶油溶出的促進作用較為明顯，主要是因為溫度升高使油茶餅組織變得疏松，細胞結構被出率呈現減少趨勢，蛋白質溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對茶油溶出的促進作用較為明顯，主要是因為溫度升高使油茶餅組織變得疏松，細胞結構被破壞；蛋白質與碳水化合物溶出趨勢相同，蛋白質和碳水化合物的溶出逐漸減少，溫度較高時，蛋白質和碳水化合物結構遭到破壞，其活性成分受到影響，蛋白質和碳水化合物溶出減少，有利于茶皂素純度的增加。綜合考慮選取80 ℃為最佳萃取溫度。

圖1 pH對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖2 萃取溫度對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖3 萃取液料比對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.3 液料比對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取液料比對各成分溶出及茶皂素純度影響不相同，最佳液料比可避免造成資源浪費。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在液料比4∶1 ～12∶1 mL/g范圍內，茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質和碳水化合物溶出率一直在增加，茶油溶出率從63.48%增加到76.15%，茶皂素溶出率從55.69%增加到92.20%，磷脂溶出率從30.22%增加到39.07%，蛋白質溶出率13.99%增加到29.07%，碳水化合物溶出率從4.35%增加到12.04%，隨液料比增加油茶餅中有效成分溶出率趨勢相同，茶皂素純度呈現出先增加后減小的趨勢，液料比增加有利于溶劑與物料的充分接觸，但液料比較大時，雜質溶出也會越多。在液料比10∶1 mL/g時，茶皂素純度達到最大值78.26%。在該體系中茶皂素分子溶出競爭力較大，溶出率增加較為明顯。綜合考慮選取10∶1 mL/g為最佳萃取料比。

3.2.4 正丁醇含水量對油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

正丁醇、茶皂素、茶油和水互溶后可形成一個極性可調的溶劑體2系，該體系具有“雙親增溶”特性，適用于油茶多組分的同步提取。因此考察含水量對溶出率及茶皂素純度的影響。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、萃取時間120 min，在正丁醇含水量0～20%(質量分數)范圍內，茶皂素溶出率從19.29%增加到91.54%；茶皂素純度從48.38%提高到78.12%；隨著正丁醇含水量的增加，茶油和磷脂溶出率先輕度降低再增加；蛋白質溶出率增加；碳水化合物溶出率隨含水量增加而增加。隨著茶皂素的溶出，能夠有效的改變正丁醇-水體系的極性大小，形成一個“雙親增溶”體系對茶油具有一定的增溶作用，從而實現茶油、茶皂素的同步高效溶出[25]。正丁醇含水量20%時，茶皂素溶出率為91.54%，純度為78.12%，與易笑生等[26]進行的正丁醇(含水量5%)萃取茶皂素和茶油相比，茶皂素溶出率提高48%，茶皂素在水中的溶解性稍大于在正丁醇中的溶解性，由于水在正丁醇中的最大溶解度為20.1%(質量分數)，綜合考慮選取正丁醇含水量20%為最佳萃取含水量。

圖4 正丁醇含水量對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.5 萃取時間對油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

傳統提取方法中大多數存在提取時間長的缺陷，就會造成效率低，設備利用率低等問題，縮短時間能有效的節約成本，創造更大的經濟價值。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%，在萃取時間30～120 min范圍內，隨時間的增加茶皂素、茶油、磷脂、蛋白質和碳水化合物的溶出率呈現出增加的趨勢。在萃取初期，萃取時間越長，各有效成分的溶出率也就越高。隨著時間的延長，各有效成分溶出率有略微下降，這可能是因為有效成分在溶劑中溶解度達到飽和，萃取時間較長，茶皂素可能發生水解；在該體系中萃取時間120 min時，茶皂素溶出率達到90.1%，馬力等[27]在以水為溶劑萃取油茶餅中茶皂素時達到相似溶出率需要萃取時間8 h；茶皂素純度隨萃取時間的延長而降低，萃取時間越長雜質溶出越多對茶皂素純度影響越大。綜合考慮選取萃取時間120 min為最佳萃取時間。

圖5 萃取時間對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.3 同步萃取油茶餅多組分最佳工藝響應面試驗結果與分析

3.3.1 響應面實驗結果

根據單因素實驗結果，萃取pH、萃取溫度、萃取液料比對茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大，因此響應面試驗以茶皂素溶出率及茶皂素純度為響應值采用3因素3水平的響應面分析方法，以萃取pH、萃取溫度、萃取液料比為自變量對工藝參數進行優化。設計因素與水平編碼表如表2及表3所示。

3.3.2 響應面優化分析

運用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行分析處理，得到方差結果，如表4所示。

Y1(茶皂素溶出率)=91.89-1.04A+0.80B+1.79C+0.29AB+0.19BC-2.61A2-0.31B2-1.88C2

Y2(茶皂素純度)=78.72+0.51A+0.33B+0.31C+0.28AC-2.591A2-0.73B2-0.99C2

由表4、表5可知，A、B、C、A2、B2、C2對響應值茶皂素的溶出率及茶皂素的純度影響極顯著(P<0.000 1)。失擬差P>0.05，表明模型的失擬度不顯著，回歸系數R2分別為0.999 2、0.996 4，表明預測值與試驗值具有良好的擬合性，校正后的復測相關系數Radj2分別為0.998 2、0.991 7，測試值與校正值均較大且較為接近，表明該模型擬程度良好。

表2 Box-Benhnken實驗因素及其水平表

表3 Box-Benhnken實驗結果表

表4 茶皂素溶出率的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

表5 茶皂素純度的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

3.3.3 交互作用分析

根據模型方差分析可以得出萃取pH、萃取液料比和萃取溫度對茶皂素溶出率影響極顯著，兩因素的交互作用對茶皂素溶出率的影響較大的是萃取pH和萃取溫度、萃取溫度和液料比。隨著萃取pH的增加，茶皂素溶出率先增加達到最高值后下降，茶皂素溶出率的下降可能是當pH較大時引起茶皂素的水解[28]；萃取pH與萃取液料比之間交互作用不顯著，這可能是因為實驗中考察這兩個變量的范圍較小，沒有更好的顯示出變量范圍更大后的交互作用變化規律；萃取溫度對茶皂素溶出率影響較小。

對茶油餅中茶皂素純度響應值的影響及其交互作用中萃取pH對茶皂素純度的影響程度最大，萃取溫度次之，萃取液料比影響最小，兩因素的交互作用對茶皂素純度的影響較明顯的是萃取pH和萃取液料比。隨萃取pH的增加，茶皂素純度呈現先增加后減小的趨勢，茶皂素純度降低的原因可能是萃取pH增加會導致更多雜質溶出。

根據二次回歸方程的數學模型分析，得到的最佳萃取工藝條件：萃取pH為4.52、萃取溫度83.80 ℃、萃取液料比10.60 mL/g、在此條件下茶皂素溶出率及茶皂素純度理論值分別為92.50%、78.76%。在驗證響應面法的可行性的基礎上，為了便于實際的操作，將最佳工藝條件修正為萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g。

3.3.4 回歸模型的驗證

按照優化后的工藝條件進行3次平行實驗以驗證BBD設計所得結果的可靠性，試驗所得茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%，與理論預測值相比無明顯差異，基本符合理論，表明所建的模型有效。

3.3.5 本方法與醇提和水提對比

本方法與醇提法、水提法萃取效果對比見表6，本方法具有提取率高、產品純度較高的優勢。

表6 不同復合溶劑萃取效果比較

4 結論

正丁醇/水復合溶劑處理油茶餅粕，研究各組分溶出的規律及其相互作用關系，重點研究各組分的相互作用對茶皂素純度的影響規律。通過單因素實驗分析確定油茶餅多組分同步萃取的工藝條件為萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min。在單因素實驗結果基礎上，通過響應面試驗設計考察萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個因素及其相互作用對茶皂素溶出率及純度的影響，得出最佳提取工藝：萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g，在該條件下，茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%。與傳統提取方法相比，正丁醇/水復合溶劑萃取茶皂素的提取率顯著提高，碳水化合物等難分離物質顯著減少，有利于茶皂素的進一步純化利用。