油菜抗菌肽基因BnCRP1的克隆表達和活性分析

曹慧慧 王 磊 閆艷華 林 田 柯 濤 黃軍艷 程曉暉 劉勝毅

(中國農業科學院油料作物研究所；農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室1，武漢 430062)(唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心2，唐山 063000)(南陽師范學院生命科學與技術學院3，南陽 473061)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPS)是一類對細菌、真菌等微生物有抑制或殺滅作用的天然小分子多肽，在自然界中分布廣泛，普遍存在于動物、植物、微生物、昆蟲和細菌中，是機體非特異性免疫的重要組成部分?？咕囊蚱淇咕鷻C理獨特，具有高效、環保、抑制病原菌產生耐藥性等優點，在生物防治、養殖飼料、食品添加劑和醫學上具有良好的應用，同時也是未來抗生素的理想替代品[1-3]。

植物源抗菌肽又稱為植物防御素，是植物體內合成的能夠防御外界微生物侵害的一類小分子多肽，是植物防御系統的屏障。植物源抗菌肽的特點是其氨基酸序列中通常富含半胱氨酸，容易形成二硫鍵，因此植物抗菌肽也被稱為半胱氨酸富集類多肽。按照氨基酸序列及二級結構，已發現的植物抗菌肽至少可以分為8個家族：植物防御素(Plant defensins)、脂轉移蛋白(Lipid Transfer Proteins，LTPs)、硫素(Thionins)、蛻皮素(Snakins)、橡膠蛋白類 (Hevein-like)、打結素類(Knottin-likePeptides)、鳳仙花素(IbAMP)、MBP1等[4]，它們的分子質量大小一般為2～9 ku，氨基酸序列中含有的半胱氨酸能夠形成2～6個二硫鍵起到穩定蛋白結構的功能。與動物來源的抗菌肽相比，植物源抗菌肽由于其作用溫和、對動植物細胞沒有毒性，易于在作物中表達和調控，不易被細胞內的蛋白酶降解等優點，在各個領域中應用更加廣泛，且由于植物源抗菌肽不會造成環境污染和藥物殘留等問題，長期使用也不會使病原菌產生耐藥性，具有開發成為抗真菌生物制劑的潛力，可以作為抗生素和化學殺菌劑的最佳替代產品?？咕哪壳霸谥参锊『Ψ揽刂械膽?，主要是利用基因工程手段將抗菌肽基因轉化植物中達到抗病的作用。植物源抗菌肽都具有廣譜抗真菌或細菌活性，在一種植物中發現的抗菌肽可以有效應用到其他多種植物中。如將蘿卜中來源的抗菌肽Rs-AFPs通過轉基因的方法轉到馬鈴薯和小麥中分別達到抗馬鈴薯晚疫病和小麥鐮刀的效果[5-7]?？咕淖鳛樾屡d抗病基因資源，對改良水稻、大豆、棉花、油菜等作物對真菌病害的抗性有著重要意義。植物源抗菌肽具有相對于動物源抗菌肽的諸多優點，但是，目前植物來源的抗菌肽還很難真正應用到農業生產實踐中。主要原因是目前鑒定的有功能的植物來源抗菌肽數量很少，抗菌肽數據庫中經過驗證的抗菌肽基因目前達到3 055個，而植物抗菌肽僅有345個[8]。因此高效地預測具有功能的新型植物抗菌肽，并實現其高水平表達成為獲得新型植物抗菌肽基因的主要技術難點，本研究充分利用生物信息學、分子生物學和微生物學等主要技術手段，利用公共數據庫中油菜EST序列信息和本實驗室已經完成的甘藍型油菜親本種白菜和甘藍及甘藍型油菜全基因組測序數據信息[9-11]，通過生物信息學分析手段，預測油菜中新的抗菌肽候選基因，獲得了一批與已知抗菌肽有類似序列結構的候選基因，從中篩選出感興趣的基因，利用特殊的表達純化標簽體系進行原核表達和體外抗菌活性檢測，獲得了一個新的對細菌、酵母和植物病原真菌核盤菌都具有明顯抑菌活性的轉脂蛋白抗菌肽基因BnCRP1，為高通量發掘和篩選植物抗菌肽基因提供了借鑒,為植物抗病遺傳改良提供新基因源。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：用于克隆和活性檢測的大腸桿菌(Escherichiacoli)XL-10-Gold ATCC2592、用于原核表達的大腸桿菌BL21(DE3)菌株均購自Novagen公司；用于活性檢測的革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(MicrococoluteusACCC11001)，用于活性檢測的畢赤酵母(Pichiapastoris)GS1115、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)為實驗室所保存。載體pET30α-EDDIE-GFP[12]為本實驗室所構建、保存。

主要試劑：DNA聚合酶、DNA Marker、Tricine、Urea、DTT、IPTG；低分子質量蛋白質Marker。質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽基因的預測

本實驗室開展了甘藍型油菜親本種白菜(Brassicarapa，AA, 2n=20)和甘藍(Brassicaoleracea，CC, 2n=18)以及甘藍型油菜(B.napus，AACC,2n=38)全基因組測序信息并建立了可供查詢的數據庫(http://brassicadb.org/brad，http://www.ocri-genomics.org/bolbase，http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/BoulosChalhoub)[10,13,14]；此外，還進行了油菜不同組織包括根、莖、葉、角果等的表達譜分析，獲得了大量的EST數據信息。根據油菜序列信息，與已有的抗菌肽數據庫(如ANTIMIC[15]、APD[8]、APPDB[16]和PhyAMP[17]等)收錄的抗菌肽序列進行BLAST比對，篩選出一些與已知抗菌肽具有類似結構的抗菌肽候選基因，并對這些篩選得到的候選抗菌肽基因進行結構預測和分類，最終獲得潛在的新抗菌肽基因。

1.2.2 抗菌肽基因BnCRP1的合成和表達

pET30α-EDDIE-BnCRP1的構建根據獲得的BnCRP1抗菌肽基因的DNA序列，利用DNA Works軟件[18]，對其進行密碼子優化(根據大腸桿菌密碼子進化優化)并設計引物，通過Overlap-PCR的方法合成目標基因序列[19]。合成Overlap-PCR引物序列4條(表1)。載體線性化引物為Backbone-F:TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和Backbone-R：GCAGCTGGTCACCCACAGCG。

根據Ke等[12]報道的方法，將BnCRP1基因連接到融合表達載體pET30α-EDDIE-GFP上。先將pET30α-EDDIE-GFP載體利用Backbone-F: TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和Backbone-R：GCAGCTGGTCACCCACAGCG引物通過PCR擴增進行載體線性化，采用50 μL體系：10×Taq buffer(含MgCl2)5 μL，1.5 mmol/L dNTP(10 mmol/L)5 μL，5′引物(10 μmol/L)2 μL，3′引物(10 μmol/L)2 μL，Taq(5 U/μL)1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O 31 μL。反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，25個循環；72 ℃后延伸10 min。

表1 Overlap-PCR引物序列

注：下劃線的序列與載體PET30α-EDDIE-GFP同源，其余為目標基因的特異性引物。

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后，電泳后切膠回收6 kb線性化載體片段。

采用Overlap-PCR技術獲得BnCRP1基因全長。PCR反應體系如下：總的反應體系為50 μL，內含：10×Taq buffer (含MgCl2)10 μL，1.5 mmol/L dNTP(10 mmol/L)4 μL，引物back bone F和backbone R各加入1 μL(濃度為10 mmol / L)，引物BnCRP_1、BnCRP_2、BnCRP_3和BnCRP_4各加入1 μL(濃度為2 mmol/L)，Taq(5 U/μL)1 μL，ddH2O 33 μL。反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 2 min 30 s，25個循環，72 ℃后延伸10 min，擴增大小為102 bp。采用反向PCR技術，將BnCRP1基因連接到表達載體pET30a/His-EDDIE-GFP上。具體為利用30α backbone-F和30α backbone-R引物，通過反向PCR擴增，將pET30a/His-EDDIE-GFP載體線性化。將回收到pET30a/His-EDDIE-GFP線性化載體片段與通過Overlap-PCR擴增回收得到的BnCRP1全長DNA片段，同時轉化大腸桿菌XL10-Gold菌株，通過體內定點同源重組，將BnCRP1基因連接到表達載體pET30a/His-EDDIE-GFP上，獲得目的基因融合表達載EDDIE-BnCRP1。

1.2.3 抗菌肽基因BnCRP1的體外誘導表達和分離純化

為解決抗菌肽異源表達的諸多問題，本研究采用一種新的融合表達抗菌肽的方法，采用豬瘟病毒蛋白突變體EDDIE為融合蛋白，以包涵體形式在大腸桿菌BL21中高效表達抗菌肽，以減少抗菌肽對宿主的毒性作用。在包涵體蛋白純化、復性后，EDDIE重新正確折疊，恢復其自剪切能力，在特異位點Cys168和Cys169處把C端融合的抗菌肽剪切下來，從而獲得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽產物。該方法不需要添加任何化學物質和酶來去掉融合標簽，對宿主無毒性，純化過程簡單，剪切后可直接用來檢測對病原菌的抗菌活性，最高目標產量可以達到12 g/L。

將測序正確的表達載體pET30α-EDDIE-BnCRP1質粒，用熱激法轉化到BL21(DE3)感受態細胞中，在加有卡那霉素的LB平板上劃線挑取單菌落，并接種于含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩過夜，然后以100∶1的比例接種至LB液體培養基中，同樣條件下培養3 h至OD600=0.6左右時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達6 h，用破菌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，2 mmol/L EDTA, pH 8.0)冰浴條件超聲破碎5 min，4 ℃條件下5 000 r/min 離心15 min收集包涵體沉淀，將收集到的沉淀用緩沖液(1% TritonX-100，1 mol/L NaCL)清洗2次，再次收集菌體。以體積比10∶1的比例將包涵體溶于尿素變性緩沖液(8 mol/L Urea, 50 mmol/L Tris pH 7.5, 25 mmol/L DTT)中，室溫條件下振蕩2 h，4 ℃條件下2 000r/min離心20 min，取上清液，然后按照1∶50的比例快速稀釋到復性緩沖液(500 mmol/L NaCL, 20 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，5% Glycerol , 0.2 mmol/L Arginine，10 mmol/L DTT，0.01% Tween-20，pH 8.5～9.5)中，室溫放置6 h復性。復性的過程即是EDDIE蛋白發生自剪切的過程，利用Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測剪切結果，并利用NanoDrop-2000測定復性后抗菌肽的蛋白濃度。

1.2.4 抗菌肽BnCRP1的體外活性測定

抗菌肽BnCRP1對細菌抑菌活性的測定分別以藤黃微球菌為革蘭氏陽性菌代表，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌代表，用牛津杯法[20]在每個牛津杯中加入濃度為3 mg/mL的人工表達純化的抗菌肽溶液200 μL，并以相同濃度的委托生物公司化學合成抗菌肽作為對照，37 ℃環境下(酵母培養溫度為22～25 ℃)培養12～16 h(酵母培養時間為48 h)，通過測定抑菌圈的大小來確定抗菌肽的活性，共進行3次實驗，每次實驗進行3個技術重復。

抗菌肽BnCRP1對植物病原菌核盤菌的抑菌活性的鑒定方法：1)菌核與菌絲塊的處理：選擇完好的核盤菌菌核，用10 mL左右的75%酒精浸泡1 min，然后在10 mL 0.1%的HgCl2中浸泡消毒8～10 min，隨后用無菌水沖洗3～5次，把滅菌菌核切掉兩端，中間部分切成綠豆大小的顆粒，接種于PDA平板上，切面朝下放置。通常每粒菌核接種1板，1次接種8～9板。當菌絲即將鋪滿平板時，用直徑為2 mm的打孔器沿菌絲外緣打孔，取菌絲塊，用于再次接種；2)菌絲培養：將用打孔器去除的菌絲塊置于新的PDA平板的正中間位置，使含有菌絲的一面接觸PDA平面，放置于22 ℃條件下靜置培養3～4 d；3)抑菌活性的檢測：PDA平板上培養好的菌絲用打孔器取最外圈生長良好的菌絲塊置于新的PDA平板上，在菌絲塊的上下左右的位置各放置1個牛津杯，分別加入人工合成純化的抗菌肽和化學合成的抗菌肽，繼續培養48 h，觀察抑菌情況。細菌抑菌率的計算可通過直接測量抑菌圈的大小來完成，真菌抑菌率的計算方法按照：抑菌率=[空白對照菌絲半徑(a)-抗菌肽作用后菌絲半徑(b)]/空白對照菌絲半徑(a)×100%，菌絲半徑的計量單位為cm。

為了檢測抗菌肽BnCRP1作為生防制劑用于植物對真菌性病害的抗性潛力，通過在植物葉片表面進行噴施一定濃度的人工純化抗菌肽溶液，然后在噴施過抗菌肽的植物葉片上接種病原真菌，36 h后測定病斑的大小，同一條件下未噴施的植物葉片作為對照。具體實驗方法是：選取生長5周左右的擬南芥葉片，在葉片表面均勻涂抹一層濃度為5 ng/μL人工表達純化后的抗菌肽BnCRP1，同時在PDA平板上培養核盤菌，當菌絲即將鋪滿整個平板時，用直徑為1 mm的打孔器沿菌絲邊緣打孔，取菌絲塊，用于擬南芥的接種。用注射器針頭將打孔器取出的菌絲塊置于擬南芥的葉片正中央的位置，使含有菌絲的一面接觸葉片表面，同時在未涂抹抗菌肽的擬南芥葉片上按照同樣的方法進行接種核盤菌菌絲塊作為對照，22 ℃條件下，濕度保持在90%培養36 h后觀察感病情況，并測量各個葉片上的病斑的大小。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽基因的預測和序列結構分析

與已知的抗菌肽數據庫中抗菌肽進行氨基酸序列的同源性比對，從基因組水平上高通量篩選出一批與已知抗菌肽有類似序列結構特征的候選抗菌肽基因。將BnCRP1的氨基酸序列與已知的抗菌肽數據庫中的抗菌肽進行同源序列比對發現，與APD數據庫中編號為AP01582來源于黃星桑天牛(Psacotheahilaris)中的一類3D結構為Bridge類隸屬于Knottin～Type打結素類抗菌肽的相似性最高，相似度達到36.36%，這種由黃星桑天牛中分離到的bridge類抗菌肽具有較強的抗革蘭氏陽性菌、抗革蘭氏陰性菌和抗真菌活性[21]。

通過蛋白結構分析網站，對BnCRP1的蛋白結構進行分析和預測，發現抗菌肽BnCRP1主要表現為螺旋結構，其序列組成中的9個半胱氨酸能夠形成4對二硫鍵，起到穩定抗菌肽結構的作用。蛋白結構預測顯示BnCRP1的二級結構中由50%的α螺旋和50%的無規卷曲組成。這種蛋白結構決定了它所發生的抗細菌和抗真菌的作用模式為通過破壞細胞膜的機制來達到抑菌的作用[22]。蛋白三維結構預測的結果也支持該結果，從N端形成一個大的α螺旋，其余部分形成無規卷曲的結構(圖1)。

圖1 抗菌肽BnCRP1的二級結構

2.2 抗菌肽基因BnCRP1的合成和原核表達載體的構建

Overlap-PCR合成目標基因，經1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測，條帶大小為102 bp，符合預期(圖2)，以構建的BnCRP1原核表達載體pET30α-EDDIE-BnCRP1為模板，用基因特異性引物進行擴增，電泳檢測結果顯示，重組子的條帶大小與合成目標基因條帶大小一致，通過測序證明本研究構建的pET30α-EDDIE-BnCRP1正確。

注：M為2 000 bp DNA ladder；1為表達載體重組子；2為陰性對照；3～6為BnCRP1人工合成基因。圖2 Overlap PCR合成BnCRP1基因的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 抗菌肽BnCRP1的體外誘導表達和分離純化

按照1.2.3所描述的方法，重組蛋白pET30α-EDDIE-BnCRP1誘導表達后，將上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE檢測，結果如圖3a所示，泳道1～6在21 ku處有一條表達量明顯增大的條帶(圖3a中箭頭所示)，且大小符合EDDIE-BnCRP1融合蛋白的預期，說明EDDIE-BnCRP1融合蛋白主要存在于沉淀中，并且是以包涵體的形式進行表達。融合蛋白包涵體復性后，通過Tricine-SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白EDDIE-BnCRP1的自剪切效果，結果如圖3b中所示，泳道1和2在3.6 ku處有一條抗菌肽BnCRP1的目的條帶，說明EDDIE在復性后能夠將抗菌肽BnCRP1目的蛋白進行高效自剪切。

注：0為EDDIE-BnCRP1上清；1～6為EDDIE-BnCRP1沉淀；7～8為復性后6 h的融合蛋白EDDIE-BnCRP1; M為小分子量蛋白標記。圖3 表達蛋白EDDIE-BnCRP1(a)和EDDIE-BnCRP1復性后(b)的SDS-PAGE圖

2.4 抗菌肽BnCRP1的抗菌活性測定

分別以大腸桿菌為革蘭氏陰性菌代表，藤黃八疊球菌為革蘭氏陽性菌代表，酵母菌為真菌代表，以復性液作為對照，對復性后的BnCRP1進行抑菌實驗檢測。結果如圖4所示，同時檢測了抗菌肽BnCRP1對植物病原菌核盤菌的抑菌活性。結果顯示，人工合純化抗菌肽BnCRP1和化學合成抗菌肽BnCRP1具有明顯的抑菌效果。而以復性液為對照的牛津杯周圍并未出現明顯的抑菌圈，經過3次生物學重復測量得到抗菌肽BnCRP1對大腸桿菌、藤黃八疊球菌和酵母菌的平均抑菌直徑分別為1.53、1.11和1.67，對核盤菌的抑菌率達到了70%。

注：0為復性緩沖液；1為體外表達純化抗菌肽BnCRP1; 2為化學合成抗菌肽。圖4 抗菌肽BnCRP1 抗細菌和真菌活性檢測

2.5 抗菌肽BnCRP1在植物抗病中的應用

為了研究抗菌肽BnCRP1作為生防制劑在植物真菌性病害防治中的作用，通過在擬南芥葉片涂抹或噴施抗菌肽BnCRP1并接種核盤菌的方法，檢驗抗菌肽對植物真菌性病害的抗病潛力，結果如圖5所示，涂抹抗菌肽的擬南芥葉片與未涂抹抗菌肽的擬南芥葉片相比，接種核盤菌36 h后的病斑面積顯著減小。這說明在植物葉片噴施抗菌肽BnCRP1有顯著抑制核盤菌侵染擴散的作用，有效提高了植物對植物病原真菌核盤菌的抗性。

注：a為表面涂抹抗菌肽BnCRP1的擬南芥葉片；b為表面未涂抹抗菌肽BnCRP1的擬南芥葉片。圖5 擬南芥離體葉片接種核盤菌抗病鑒定

3 討論

植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80%以上的植物病害，造成世界糧食作物減產約20%。許多重要植物病害都是真菌造成的，如馬鈴薯晚疫病、稻瘟病、小麥白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成巨大的經濟損失。另外，真菌在侵染植物的過程中，釋放出來的代謝產物—真菌毒素(mycotoxin)，對農作物以及人類的健康也造成極大的危害，如黃曲霉毒素(aflatoxin)等。核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)屬于子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤菌科、核盤菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤菌可以廣泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。核盤菌引起的菌核病是一種類似于灰霉的腐生營養型真菌，這種破壞性病源侵染超過400種植物，分布廣泛。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根、莖和角果的腐爛，導致了巨大的產量損失。盡管菌核病嚴重威脅了農業生產，植物對核盤菌的寄主抗性的分子機制依然不清楚。迄今為止還沒有發現完全免疫或者高抗的油菜栽培品種，因此，探究植物對這種病源的抗性機制，發現新的抗性基因具有深遠意義。

目前常用的植物病害防治措施，主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、污染環境，而且防效也不理想，食品的安全性也受到嚴重影響。隨著社會的進步，人們越來越深刻地認識到長期大量使用化學農藥對生態環境和人類健康的危害。生物防治可以有效地克服這些弊端，因而生物農藥越來越受到人們的重視?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)因其高效、環保、不使病原菌產生耐藥性等優點使其在生物防治和醫學上具有良好的應用前景。

對抗菌肽的研究雖然取得了較大的進展，但抗菌肽在大規模的生產應用中還存在很多問題：一是抗菌肽的來源及提純問題，天然的抗菌肽資源有限，而且天然抗菌肽含量很低，提取純化難度較大，化學合成成本昂貴，這些現有的困難不利于抗菌肽的大規模應用，另外通過基因工程方法獲得抗菌肽容易被蛋白酶消解；二是活性問題，抗菌肽氨基酸序列短，其活性與其空間結構密切相關，通過化學合成或者基因工程獲得的抗菌肽空間結構上無法與天然抗菌肽保持一致，因此無法保證與天然抗菌肽具有一樣的活性?？咕难芯棵媾R的挑戰一方面要不斷提高和改善抗菌肽的抗菌活性和穩定性，另一方面由于抗菌肽具有先天免疫調節作用，可以增加其先天防御調節中的應用，隨著對抗菌肽作用機理及轉基因技術的不斷深入研究與應用，光譜、高效、低毒的抗菌肽將在農業、食品、醫藥領域發揮更加重要的作用，為人類創造更大的價值。

4 結論

本研究通過生物信息學手段，利用已有的油菜全基因組測序信息和抗菌肽數據庫信息，獲得抗菌肽新基因BnCRP1,并實現了BnCRP1在大腸桿菌中的融合表達、復性、自剪切和純化，獲得了具有生物活性的BnCRP1蛋白產物。本研究為利用生物信息手段和基因工程技術大規模鑒定新植物來源抗菌肽奠定了基礎，提供了一種新的途徑。BnCRP1可作為生物試劑噴施于植物表面提高植物對真菌病害的抗性，同時，還可以作為一個新分子標記用于輔助抗病育種，還可以作為一個新基因用于植物基因工程，以培育抗病轉基因植物。